Aguirre, Andrés2025-06-122025-06-122024https://hdl.handle.net/2133/29652El aceite crudo de soja requiere de un tratamiento exhaustivo para alcanzar los estándares exigidos tanto para el consumo humano como para la producción de biodiesel. Durante este tratamiento, el aceite se somete a un proceso de desgomado con el objetivo de reducir el contenido de fosfolípidos presentes. Existen tres métodos principales de desgomado: desgomado acuoso, desgomado ácido y desgomado enzimático. Este último se caracteriza por el uso de fosfolipasas del tipo C (PLC) para hidrolizar los fosfolípidos presentes, generando diacilglicéridos y productos solubles en agua. Este proceso tiene como principal ventaja que permite hidrolizar cerca del 90 % de los fosfolípidos presentes. Además, supone un aumento en el rendimiento del proceso, ya que los diacilglicéridos generados se reparten en la fase oleosa, incrementando su volumen. Finalmente, si se compara con el desgomado acuoso, el volumen de las gomas es menor y, por consiguiente, el contenido de aceite atrapado en ellas también lo es. El presente trabajo de Tesis se llevó a cabo en un laboratorio especializado en la producción de enzimas recombinantes destinadas al tratamiento de aceites y subproductos de la industria oleoquímica. Previo al inicio de esta investigación, en dicho laboratorio se había logrado desarrollar un cóctel enzimático conformado por dos fosfolipasas de tipo C y una glicerofosfolípido-colesterol acil transferasa, que permitía la hidrólisis eficaz de los fosfolípidos presentes en el aceite crudo de soja. Sin embargo, a pesar de la eficacia del cóctel, su principal desventaja era la manufactura de dos de sus tres enzimas en Escherichia coli, un microorganismo no secretor. Esto elevaba significativamente los costos de producción y presentaba un obstáculo para la viabilidad comercial del producto. Por lo tanto, surgió la necesidad de buscar un microorganismo gram-positivo secretor que permita la expresión de las fosfolipasas presentes en el cóctel enzimático. Empleando el microorganismo gram-positivo secretor Corynebacterium glutamicum, se evaluaron siete secuencias que codifican para enzimas con actividad PIPLC. Dos de las siete enzimas fueron producidas exitosamente en el medio extracelular y su expresión se evaluó posteriormente en cultivos de alta densidad celular. Debido a la concentración obtenida, se decidió seguir trabajando con la PI-PLC de Streptomyces antibioticus (PI-PLCSa1). Dicha enzima se caracterizó en aceite, donde se optimizó tiempo de reacción, temperatura de reacción y dosis mínima. La misma presentó una actividad especifica 33 veces superior a la PI-PLC que formaba parte del cóctel enzimático desarrollado previamente en el laboratorio. Paralelamente, se llevó a cabo la producción de la enzima PC-PLCBc en C. glutamicum y se comprobó que el cóctel enzimático así conformado permite la hidrólisis completa de los fosfolípidos PC, PE y PI, sin la necesidad del agregado de la glicerofosfolípido-colesterol acil transferasa. A pesar de estos muy buenos resultados, surgió la necesidad de la búsqueda de otro microorganismo grampositivo secretor debido a que las fermentaciones de C. glutamicum carecían de reproducibilidad y presentaban el inconveniente de la constante formación de espuma cuando se alcanzaban altas densidades celulares. Para superar dicho inconveniente, se optó por evaluar a Bacillus licheniformis como microorganismo productor. Se llevaron a cabo una serie de mutaciones en el genoma con el objetivo de obtener una cepa chasis para la producción de proteínas heterólogas. Para ello, se realizaron deleciones en genes que codifican para proteasas extracelulares, factores de transcripción que regulan el proceso de esporulación, genes involucrados en la síntesis de pigmentos, autolisinas, profagos y genes que codifican para proteínas abundantes en el secretoma de B. licheniformis. Utilizando un promotor constitutivo doble, se evaluaron distintos sitios de integración para el gen que codifica para la enzima PI-PLCSa1 y se construyeron cepas productoras con tres copias en el genoma del gen que codifica para la enzima PI-PLCSa1 y dos copias del gen que codifica para la enzima PC-PLCBc. Dichas cepas se evaluaron posteriormente en cultivos de alta densidad celular, consiguiendo rendimientos similares o superiores a los obtenidos con C. glutamicum utilizando un plásmido con alto número de copias. Finalmente, se llevó a cabo el escalado del proceso de producción de la enzima PI-PLCSa1 en la planta de la empresa Keclon SA ubicada en la ciudad de San Lorenzo. Se llevó a cabo una fermentación de 15.000 litros iniciales, obteniéndose 3,4 g/L de la enzima de interés al final del proceso y 2.065 litros de una formulación con una concentración final de 11,6 g/L de PI-PLCSa1.esembargoedAccessFosfolipasasDesgomadoEscaladoPI-PLCtesisLacava, Franco EmanuelUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAttribution-NonCommercial-NoDerivs 2.5 Argentina