Díaz Paleo, Antonio Horacio2020-11-032020-11-032020http://hdl.handle.net/2133/19200La salinidad del suelo afecta a la producción agrícola limitando el crecimiento, el rendimiento y la calidad de los cultivos. La comprensión de los mecanismos de tolerancia a estrés salino es esencial para el mejoramiento genético de especies de interés destinadas a ambientes con dicha limitante. Lotus tenuis es una leguminosa forrajera perenne naturalizada en los campos bajos de la Pampa Deprimida argentina, considerada tolerante a la salinidad en estadios de germinación, plántula y planta adulta. Los mecanismos involucrados en la respuesta a estrés salino de la especie no han sido totalmente dilucidados. Se conoce que el antiporter vacuolar NHX1 es responsable de la compartimentalización de Na+ en vacuolas y, en numerosas especies, se considera fundamental en la tolerancia a la salinidad. El objetivo de la presente tesis doctoral fue estudiar la participación del antiporter vacuolar NHX1 de Lotus tenuis en su tolerancia a salinidad. Para esto, se determinó la expresión transcripcional relativa del gen LtNHX1 y de otros genes involucrados en el transporte y exclusión de sodio en genotipos contrastantes en su tolerancia al estrés, se determinó la localización subcelular del antiporter, y se estudiaron los cambios en la tolerancia a la salinidad de L. tenuis y de Arabidopsis thaliana a partir de la expresión constitutiva de la región codificante del gen. Se inició la investigación con la selección de genotipos de L. tenuis con comportamiento contrastante a la salinidad en fase vegetativa juvenil. Para esto, se evaluó el crecimiento de familias de medios hermanos (FMH) del programa de mejoramiento genético de la Unidad Integrada UNNOBA-INTA bajo distintas concentraciones salinas alcanzadas por aclimatación, en dos ensayos hidropónicos en condiciones semi-controladas. Debido a las condiciones ambientales y a la variabilidad intrafamiliar existente, el comportamiento de las FMH no fue consistente en las distintas evaluaciones. Por esto, los siguientes ensayos se realizaron en condiciones controladas con genotipos propagados vegetativamente y sin aclimatación al estrés. Se estimó un índice de tolerancia relativo y se evaluó la sobrevivencia a lo largo de tres ensayos, para finalmente seleccionar un genotipo tolerante a la salinidad proveniente de una de las FMH evaluadas previamente, y un genotipo susceptible proveniente del cultivar Pampa INTA. Posteriormente, con el fin de tener un conocimiento más acabado de los mecanismos de tolerancia a la salinidad de la especie, se compararon los contenidos de iones Na+ , K+ y Cl- , y la expresión transcripcional relativa de genes codificadores de transportadores de membrana, en distintos tejidos de los dos genotipos contrastantes bajo distintas concentraciones salinas y en distintos momentos. El agregado de sal incrementó los niveles de Na+ y Clen ambos genotipos. En raíz este incremento con respecto al control sin agregado de sal fue mayor en el genotipo tolerante. En parte aérea ocurrió lo contrario y fue el genotipo susceptible el que presentó mayores incrementos respecto al control sin sal. Esto podría indicar una exclusión de iones más eficiente, y un mayor secuestro de los mismos en las vacuolas de la raíz en el genotipo tolerante, contribuyendo a la mayor tolerancia mediante la reducción de la toxicidad iónica en la parte aérea. Los cambios en la expresión génica en las raíces apoyaron esta conjetura, debido a que el genotipo tolerante presentó un incremento en la expresión relativa de NHX1 (responsable de la compartimentalización de Na+ ), de SOS1 (relacionado con su exclusión); y de HKT1 (relacionado con la descarga de Na+ del xilema para evitar su transporte a la parte aérea). También se incrementó la expresión del gen del cotransportador CCC, posiblemente relacionado con la exclusión de Cl- . En el genotipo susceptible, el cloruro de sodio no produjo el incremento de los transcriptos de estos genes en raíz, aunque incrementó la expresión de NHX1 en hoja, lo cual resultó menos eficiente para disminuir los efectos tóxicos del Na+ que la compartimentalización en raíces presumiblemente realizada por el genotipo tolerante. En los dos genotipos se analizaron in silico las regiones 5‟ de LtNHX1, hallando en ambos casos posibles elementos reguladores relacionados con la respuesta a estrés salino y otros tipos de estrés abiótico. Se realizó el estudio de la ubicación subcelular de LtNHX1 mediante la expresión constitutiva de la proteína de fusión LtNHX1-GFP tanto en forma transitoria en Nicotiana benthamiana como en plantas transgénicas de L. tenuis. Se determinó que se trata de un antiporter NHX del grupo I, ubicado en membrana vacuolar. La expresión constitutiva de la región codificadora de LtNHX1 incrementó la tolerancia a la salinidad de una línea transgénica de A. thaliana en fase de germinación y en etapa vegetativa, tanto cuando el estrés fue impuesto por shock como por aclimatación. También se incrementó la tolerancia a la salinidad en etapa vegetativa de una línea transgénica de L. tenuis con sobreexpresión de LtNHX1. En conclusión, se confirmó que el antiporter NHX1 de L. tenuis se ubica en membrana vacuolar y participa en la tolerancia a la salinidad de la especie mediante la compartimentalización de Na+ en las vacuolas de las raíces, complementando la actividad de otros transportadores que reducen o retrasan el transporte de Na+ a la parte aérea de las plantas.Lotus tenuis, commonly known as “lotus” or “narrow-leaf birdsfoot trefoil”, is a perennial, allogamous, diploid pasture legume that is naturalized in the Flooding Pampa region of Argentina. It is considered a salt tolerant species. It is known that the NHX1 vacuolar antiporter is responsible for the compartmentalization of Na+ in vacuoles and, in numerous species, is considered essential in salinity tolerance. The aim of this work was to study the contribution of Lotus tenuis NHX1 vacuolar antiporter to its salinity tolerance. Two genotypes with contrasting level of tolerance were selected, and changes in ion contents and in the gene expression of NHX1 and other membrane transporters were studied. The tolerant genotype showed signs of greater exclusion and compartmentalization of Na+ in roots. The tolerant genotype showed an increase in the relative expression of NHX1 (responsible for the compartmentalization of Na+ ); SOS1 (related to its exclusion) and HKT1 (related to the retrieval of Na+ from the xylem). The expression of the CCC cotransporter gene, possibly related to the exclusion of Cl- , was also increased. In the susceptible genotype, sodium chloride did not cause an increase in the transcripts of these genes in roots, but it increased the expression of NHX1 in leaf, which was less efficient in reducing the toxic effects of Na+ than root compartmentalization present in the tolerant genotype. The study of the subcellular location of LtNHX1 was performed by constitutive expression of the fusion protein LtNHX1-GFP. It was confirmed that it is a group I NHX antiporter, located in vacuolar membrane. The constitutive expression of the coding region of LtNHX1 increased the salinity tolerance of Arabidopsis thaliana in germination and vegetative stage. The overexpression of LtNHX1 in L. tenuis also increased salinity tolerance in vegetative stage. In conclusion, it was confirmed that the Lotus tenuis NHX1 vacuolar antiporter is located in vacuolar membrane and contributes to the salinity tolerance of the species through the compartmentalization of Na+ in root vacuoles, complementing the activity of other membrane transporters that reduce or delay Na+ accumulation in shoots.application/pdfspaopenAccessLotus tenuisTolerancia a la salinidadSuelosAntiporter vacuolarEstrés salinodoctoralThesisMaría Agostina Affinito