Palatnik, Javier F.2025-06-232025-06-232024https://hdl.handle.net/2133/29709Los miARNs son ARN pequeños de 20-22 nt, de codificación endógena. Son transcriptos por la ARN Polimerasa II en forma de transcriptos largos que se pliegan sobre sí mismos formando una estructura intracatenaria de tallo-burbuja de apareamiento imperfecto. Esta estructura contiene los determinantes necesarios para su reconocimiento y procesamiento por parte de DICER-LIKE1 (DCL1). El dúplex miARN/miARN* es liberado y una de estas hebras es seleccionada y cargada en ARGONAUTA1 (AGO1). El complejo AGO1-miARN es exportado al citoplasma donde es capaz de detectar al ARN blanco, al cual reconoce por complementariedad de bases. Este complejo puede regular post-transcripcionalmente la expresión génica bloqueando la transcripción o bien empleando la actividad endonucleolítica de AGO1, que corta al transcripto blanco entre las posiciones 10 y 11 del miARN. El procesamiento de los miARNs en plantas es diverso debido a las diferencias en la estructura de sus precursores (pri-miARN). El complejo DCL1 puede procesar estos pri-miARN de dos maneras: base-to-loop, cuando un tallo de 15-17 nucleótidos está por debajo del dúplex miARN/miARN*, o loop-to-base, cuando el tallo está por encima. Tras un primer corte, DCL1 realiza un segundo a 21 nucleótidos para liberar el dúplex miARN/miARN*. Este proceso puede completarse en dos cortes (procesamiento en dos pasos) o en varios cortes sucesivos (procesamiento secuencial) generando varios dúplex hasta liberar el ARN funcional con actividad biológica. En esta Tesis, en primer lugar, nos enfocamos en las estructuras de los dúplex miARN/miARN*, haciendo un análisis exhaustivo de la posición, identidad y cantidad de mismatches, y cómo la modificación de estos impactaba sobre la acumulación del miARN maduro. Además, comparamos este efecto teniendo en cuenta el mecanismo de procesamiento, y en última instancia la función biológica y la conservación evolutiva de los MIARNs. Nuestros hallazgos indican que la estructura del dúplex miARN/miARN* tiene un rol crucial para la acumulación del miARN maduro, dependiendo del mecanismo de procesamiento del precursor. Además, encontramos que la mayoría de los precursores de miARNs sufren un procesamiento sub-óptimo in vivo, que puede ser mejorado al ajustar los niveles de energía del miARN/miARN* en los MIARNs procesados en dos pasos. Sin embargo, los MIARNs secuenciales tienen diferentes requerimientos. Encontramos que el miARN/miARN*, que se genera en los dos últimos cortes de DCL1 es el dúplex más estable de todos los que se generan cuando estos precursores son procesados. En contraste, los otros ARN pequeños tienen varias bases desapareadas en su región central, lo que origina dúplex con bajas energías de interacción y niveles finales reducidos. Además, encontramos que los distintos roles regulatorios de los dúplex de miARN/miARN* en el procesamiento de los MIARNs se correlaciona con su conservación de secuencia a lo largo de la evolución. Luego, usando la información disponible en bibliotecas de ARN pequeños publicadas, analizamos cómo diferentes mutantes de la ruta de biogénesis de siARNs heterocromáticos afectan la acumulación de miARNs. Estos siARNs están involucrados en el silenciamiento génico transcripcional, ya que regulan la metilación del ADN genómico. Observamos que la supresión de la biogénesis de siARNs en mutantes como rdr2 y dcl234 provoca un desbalance en la acumulación de ciertos miARNs. Los miARNs con un 5’A terminal se acumulaban en mutantes de la ruta de los siARN heterocromáticos. En estas mutantes además se favorecía el aumento de la relación miARN/miARN* cuando el miARN* tenía un 5’A. Esta especificidad en la acumulación sugiere una competencia entre diferentes ARN pequeños por las proteínas AGO, que en ausencia de sus sustratos naturales, cargan otros ARN pequeños, como los miARNs con 5’A Un descubrimiento clave es la acumulación diferencial del miR319.2, derivado del precursor de MIR319, en las mutantes rdr2 y dcl234. Encontramos que el locus de MIR319a experimenta un aumento en la metilación en estas mutantes, lo que sugiere que el miR319.2 podría guiar a la maquinaria de metilación del ADN, vinculando así la regulación post-transcripcional y transcripcional. Complementariamente, el enriquecimiento de la proteína AGO4 en el locus de MIR319a refuerza la hipótesis de que este miARN podría desempeñar un papel importante en el silenciamiento génico dependiente de ARN. Proponemos que el miR319 tiene una función dual, actuando tanto en la regulación post-transcripcional como en la regulación transcripcional a través de la metilación del ADN en condiciones específicas de desarrollo o estrés. Finalmente, los conocimientos obtenidos en esta tesis no solo aportan nueva información sobre los mecanismos de procesamiento de miARNs, sino que también abren la puerta a aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La posibilidad de ajustar los niveles específicos de miARN maduro modificando su estructura secundaria, así como el uso del precursor de miR319 como una herramienta para el silenciamiento génico transcripcional y post-transcripcional, permiten su aplicación en el diseño de miARNs artificiales destinados a regular la expresión de genes específicos, tanto en contextos de desarrollo como en respuesta al estrés, con un gran potencial para la mejora de cultivos.esembargoedAccessMicroARNArabidopsisProcesamientoPTGStesisRosatti; SantiagoUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAttribution-NonCommercial-NoDerivs 2.5 Argentina