Larocca, María Cecilia2021-09-222021-09-222017http://hdl.handle.net/2133/22119La distribución asimétrica de los componentes celulares que se asocia al concepto de polaridad celular es un requisito esencial para todo proceso biológico. El correcto posicionamiento de organelas, el tráfico vesicular, la generación de dominios de membrana y el reordenamiento del citoesqueleto estructuran distintos tipos de polaridad celular que facilitan funciones de la célula en determinado momento y espacio. De particular interés en la presente tesis es la polaridad apico-basolateral epitelial capaz de permitir el desarrollo de compartimientos biológicos con composición distintiva, y la polaridad antero-posterior de las células migratorias. La función de barrera biológica selectiva de los tejidos epiteliales depende en gran parte de la formación de protrusiones de membrana enriquecidas en filamentos de actina denominadas microvellosidades, o “brush border”. Estas se localizan en la cara apical de células con polaridad epitelial columnar, entre las cuales los enterocitos son un grupo modelo. Diversos procesos fisiológicos o fisiopatológicos llevan, a través de una transición epitelio-mesenquimal, a un reordenamiento de la polaridad epitelial hacia una polaridad antero-posterior capaz de facilitar el movimiento direccionado necesario para diferentes funciones biológicas como ser: el desarrollo embriogénico, la reparación de tejido epitelial o la metástasis tumoral. Este reordenamiento subcelular involucra especialmente a dos organelas que actúan como centros organizadores de microtúbulos (MTOC), el aparato de Golgi y el centrosoma que se polarizan hacia el polo celular anterior. La función coordinada de los diferentes componentes del citoesqueleto es un requisito esencial para impulsar, regular y mantener los reordenamientos de las organelas, proteínas y membranas necesarias en cada clase de polaridad celular, no sólo por sus propiedades físicas intrínsecas sino también por su rol como plataformas de señalización celular. AKAP350 es una proteína de anclaje de PKA que se localiza en el centrosoma y el aparato de Golgi. AKAP350 permite la formación de complejos moleculares que interaccionan con componentes esenciales en la regulación del citoesqueleto de microtúbulos y de actina. Estudios previos demostraron su capacidad para regular la dinámica de los microtúbulos en células epiteliales. De particular interés para esta tesis es también su proteína asociada CIP4, una proteína de andamiaje, efectora de Cdc42, capaz de mediar la curvatura de membrana y su interacción con actina. Mediante la interacción con proteínas que regulan la dinámica del citoesqueleto de actina, CIP4 interviene en eventos fundamentales de la transición epitelio-mesenquimal, que regulan la adquisición de propiedades migratorias e invasivas. De hecho, CIP4 se ha asociado a la adquisición de propiedades migratorias e invasivas en células tumorales. En la primera etapa de la presente tesis se estudió el rol de los microtúbulos en el proceso de formación de microvellosidades en células aisladas. Para ello se realizaron experimentos de microscopía confocal y “live imaging” en células Ls174T-W4, células derivadas de enterocitos y modificadas genéticamente para desarrollar microvellosidades en cultivo. Se describió la imposibilidad de estas células de polarizar y formar microvellosidades ricas en actina en presencia de la droga desestabilizante de microtúbulos nocodazol. Por otro lado, se observó una distribución característica de los microtúbulos sub-apicales con una nucleación direccionada de extremos positivos de los microtúbulos hacia el “brush border” en las etapas tempranas de la formación de estas estructuras. Asimismo, se describió la participación de la proteína asociada a los extremos positivos CLIP170 en la formación de microvellosidades en este modelo celular. Con la finalidad de estudiar la posibilidad de una contribución diferencial de los microtúbulos regulados por AKAP350 en cada organela con función MTOC, el Golgi y el centrosoma, se utilizaron herramientas de biología molecular. El silenciamiento de la expresión de AKAP350 y la sobreexpresión de su dominio localizador en Golgi, afecto la nucleación de microtúbulos de esta organela y no así los microtúbulos centrosomales. En estas condiciones la formación de microvellosidades no se vio afectada. Por otro lado, la sobreexpresión del dominio de localización en centrosomas de AKAP350 afectó la nucleación de microtúbulos centrosomales e implicó una inhibición de la capacidad de estas células de polarizar apropiadamente. Nuestros resultados en esta primera etapa revelaron por un lado que la nucleación de microtúbulos es un requisito previo y necesario a la remodelación del citoesqueleto de actina que lleva al desarrollo de microvellosidades en enterocitos y que dicha nucleación se da con una polaridad particular en la cual la proteína CLIP170 cumple un rol fundamental. Por otro lado, demostraron que la depleción de AKAP350 en estas células afecta esencialmente la nucleación de microtúbulos derivados de Golgi, y que los microtúbulos centrosomales, pero no los de Golgi, son necesarios en las etapas iniciales de la formación de la polaridad apico-basolateral epitelial. En la segunda etapa de la presente tesis se profundizó en el estudio de la participación de la proteína AKAP350 en la adquisición de polaridad antero-posterior en células epiteliales. Se utilizaron células MDCK y HepG2 para construir líneas celulares estables que expresen el dominio AKAP350CTD que localiza AKAP350 en centrosomas. Se realizaron ensayos de cierre de herida para observar la migración celular y el correcto posicionamiento del aparato de Golgi y centrosomas hacia el polo celular anterior. Se observó inhibición en la migración celular en las líneas AKAP350CTD asociada con una deficiencia en la polaridad del Golgi y el centrosoma. Estos resultados fueron confirmados por depleción de la expresión de AKAP350 mediante siARN. Posteriormente, se estudió la participación de la proteína CIP4 en este proceso. En un principio se analizó la presencia de dicha proteína en el centrosoma de células AKAP350CTD y controles, en la monocapa o en el frente de migración. Se utilizaron técnicas de fraccionamiento utilizando centrifugación diferencial en gradiente de sacarosa y microscopía confocal de inmunofluorescencia en ensayos de cierre de herida. Estos experimentos revelaron la presencia de CIP4 en centrosomas y el enriquecimiento de CIP4 en estas organelas durante la migración celular mediante un mecanismo dependiente de AKAP350. Finalmente, realizamos ensayos de cierre de herida en células con silenciamiento de la expresión de CIP4 o con sobreexpresión del dominio de interacción de AKAP350 con CIP4, que mostraron un efecto similar sobre la polaridad antero-posterior al producido en líneas AKAP350CTD. La migración celular direccionada requiere de la formación de un eje núcleo/centrosoma hacia el frente de migración que involucra el movimiento retrógrado del núcleo hacia el polo posterior y el mantenimiento activo del centrosoma en el centroide celular. Se evaluó cuáles de estos procesos estarían siendo afectados al intervenir el mecanismo AKAP350/CIP4 utilizando técnicas de microscopía confocal para analizar el posicionamiento de cada organela respecto al centroide celular. Estos resultados revelaron que en todas las condiciones en estudio el centrosoma fue incapaz de mantenerse en el centro celular, mientras el núcleo se posicionó correctamente en el polo posterior. Existe evidencia experimental de una conexión funcional entre el núcleo y el centrosoma, mediada por el citoesqueleto. Con el fin de evaluar el rol del citoesqueleto de actina en los mecanismos observados, realizamos experimentos de disrupción de actina con la droga citocalasina D previo a los ensayos de cierre de herida en células AKAP350CTD o con disminución en la expresión de AKAP350 o CIP4. En estas condiciones las células fueron capaces de posicionar correctamente el centrosoma y recuperar una capacidad motil similar a las células controles. Los resultados de esta segunda etapa develaron un mecanismo en el que intervienen AKAP350/CIP4 relacionado con el posicionamiento correcto del centrosoma y la polaridad antero-posterior necesaria en la migración direccionada de células epiteliales. Este mecanismo involucraría el reclutamiento de CIP4 a centrosomas dependiente de AKAP350 y el remodelamiento del citoesqueleto de actina para permitir la disociación del núcleo y el centrosoma. En la tercera etapa de la presente tesis se evaluó la relevancia de la fosforilación de CIP4 por PKA en la polaridad antero-posterior y su impacto en la migración, invasión y metástasis experimental en células de hepatocarcinoma HepG2. Por un lado se estudió la migración de células AKAP350CTD y controles en un contexto de inhibición de PKA con la droga H89. Se observó una pérdida de motilidad y de polaridad antero-posterior en células controles pero no se observó efecto en células AKAP350CTD. Estudios previos del grupo, no publicados aún, revelaron cuatro posibles sitios de fosforilación por PKA en la secuencia de CIP4, los cuales fueron ensayados in vitro. Solamente la mutación de T225 por un aminoácido no fosforilable inhibió la fosforilación de CIP4 por PKA. En este trabajo de tesis se construyeron líneas celulares expresando las tres posibles variantes en el residuo T225: T225A (no fosforilable), T225E (fosfomimética) y T225 (proteína salvaje). En una primera instancia, estas células fueron sometidas a ensayos de cierre de la herida. Exclusivamente las células CIP4T225A mostraron una deficiencia en la adquisición de la polaridad antero-posterior, lo que se correlacionó con una inhibición en la migración celular. Por otro lado las células expresando la variante fosfomimética evidenciaron un incremento en la migración celular. Luego estudiamos la capacidad invasiva de los distintos clones, utilizando filtros transwells conteniendo matrigel. Observamos que, mientras que las células CIP4T225A mostraron inhibición en su capacidad invasiva, las células CIP4T225E fueron marcadamente más invasivas que las CIP4T225. Finalmente se estudió el impacto de las mutaciones en este residuo en ensayos de metástasis experimental en ratones inmunodeprimidos. Estos estudios mostraron que las células CIP4T225E tienen una mayor capacidad de formar nódulos metastásicos en pulmón. En esta tercera etapa de la tesis los resultados mostraron por primera vez una función biológica de la fosforilación de CIP4 por PKA relacionada a la polaridad antero-posterior, la migración y la invasión en células de hepatocarcinoma HepG2. Los resultados del presente trabajo de tesis demuestran por primera vez la relevancia del citoesqueleto de microtúbulos en las etapas iniciales de la formación de microvellosidades. Asimismo, develaron una vía de señalización PKA/AKAP350/CIP4 que modula la polaridad antero-posterior en células de origen epitelial y la capacidad migratoria, invasiva y metastásica de células de hepatocarcinoma.application/pdfspaembargoedAccessPolaridadAKAP350CIP4doctoralThesisTonucci, Facundo MauroUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial 2.5 Argentina (CC BY-NC 2.5 AR)