Gosparini, Carlos O.2020-03-122020-03-122018http://hdl.handle.net/2133/17760La germinación de las semillas es un proceso expansivo, definido por el ingreso de agua a los ejes embrionales y es visualizado como la protrusión radicular a través de las envolturas seminales. Los mecanismos fisiológicos y moleculares que controlan la germinación de las semillas de soja (Glycne max (L.) Merr.), y especialmente el rol del Ácido Abscísico (ABA) sobre dicho proceso, constituyen el núcleo principal del presente trabajo. Los ejes inmaduros, entre 25 y 40 días después de antesis (DDA), poseen elevadas concentraciones de ABA ([ABA]e), las cuales descienden a valores no inhibitorios hacia la madurez. Presentan en consecuencia, restricciones para germinar, con tasas de germinación in vitro crecientes con la edad. Por otra parte, los ejes embrionales maduros (45 DDA, madurez fisiológica y >60 DDA, maduros y secos) no están intrínsecamente inhibidos por la [ABA]e para germinar, aunque la germinación puede ser bloqueada bajo incubación en presencia de ABA exógeno. En base a estos conocimientos, ejes embrionales de semillas de soja, cosechadas entre los 25 y >60 DDA, constituyeron un modelo experimental adecuado para establecer relaciones causa-efecto entre el ABA y el/los posible/s responsable/s metabólico/s que participa/n de la germinación y es/son controlado/s por éste. Al mismo tiempo, permitieron centrar el foco de estudio en el órgano primario implicado en la germinación, sin tener en cuenta los demás órganos seminales que no cumplen roles decisivos en este proceso. La [ABA]e se cuantificó mediante radioinmunoanálisis, utilizando el anticuerpo monoclonal DBPA1. Para los análisis moleculares se tuvieron en cuenta dos regiones del eje embrional, una de ellas consideró a ambos extremos (plúmula + radícula) y la otra, definida como "Zona de Elongación", ZE, comprendió la porción del hipocótilo, cuyas células experimentan estrictamente la expansión, constituyendo por lo tanto, la zona principal de estudio. Se evaluó la germinación de ejes embrionales en agua destilada, y en diferentes medios de incubación. La naturaleza expansiva de la germinación fue evaluada a través del control por restricción osmótica durante la imbibición en soluciones de Polietilenglicol 8000 (PEG). La incubación en buffer pH8 tuvo por objetivo inhibir el "crecimiento ácido" descripto como evento inicial responsable del alargamiento celular durante la germinación. El control por ABA sobre las paredes celulares, impidiendo que éstas se relajen, evitando la expansión y el alargamiento del eje embrional, fue evaluado a partir de incubaciones en presencia de la hormona. La estrategia de búsqueda se orientó a identificar secuencias Expansinas, cuya actividad óptima a pH~4 es indicada sobre el crecimiento ácido de paredes celulares vegetales, resultando por lo tanto responsables primarias de la remodelación de las paredes celulares en la ZE que da lugar al proceso expansivo durante la germinación. Se evaluó la presencia de Expansinas a nivel de ADN genómico. Posteriormente, se amplificó y secuenció un fragmento (EXPAI-like) a partir de ARN mensajero (ARNm) de la ZE de ejes embrionales germinados en agua destilada, el cual presentó una alta homología con la Expansina 1 de soja. Los análisis de expresión se realizaron por la técnica de Transcripción Reversa seguida de Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa, en un único paso, semicuantitativa (RT-PCR) y en dos pasos, cuantitativa y en Tiempo Real (RT-qPCR). Los resultados mostraron la presencia de EXPAI-like mayoritariamente en la ZE de los ejes embrionales, e indicaron tanto que hubo represión por ABA y pH18 como inducción en agua destilada y PEG. Adicionalmente, la presencia del transcripto aún en ejes sin incubación determinó que EXPAI-like forma parte de las biomoléculas almacenadas en el eje embrional de la semilla de soja durante su formación. Estudios complementarios mostraron que, en presencia de un inhibidor transcripcional (a-Amanitina), los ejes embrionales germinaron, aunque a menor tasa y porcentaje que en agua destilada; en tanto no germinaron cuando la traducción fue inhibida en Cicioheximida, indicando que la germinación es posible a partir de los ARNm acumulados durante el desarrollo. Por otra parte, se registró un incremento de expresión progresiva de EXPAI-like en la ZE de ejes embrionales de 25 a >60 DDA, el cual se relacionó con la [ABA]e decreciente a través del desarrollo. Similarmente, tanto el incremento de EXPAI-like como la caída de [ABA]e ocurrieron durante la incubación en condiciones de germinación para cada edad. A partir de estos resultados se postula que EXPAI-like participaría de los eventos moleculares decisivos durante la germinación en soja, permitiendo el relajamiento de paredes celulares necesario para que la misma ocurra. Por su parte, la [ABA]e operaría reprimiendo tanto la síntesis del transcripto EXPAI-like como los eventos moleculares aguas abajo del mismo.Seed germination is an expansivo process; ¡t is defined by the embryonic axes water uptake and visualized by the radicle protrusion through seed coats. Physiological and molecular mechanisms that control soybean seed germination and, specially, the role of Abscisic Acid, ABA, constitute the main goal of the present work. Immature axes from 25 to 40 days after anthesis (DAA) have high ABA levels ([ABA]a) which decrease until non-inhibitory values at maturity. They consequently possess germination restrictions and their in vitro germination rates increase with age. On the other hand, mature embryonic axes (45 DAA, physiological maturity and >60 DAA, dry mature) are not intrinsically inhibited by [ABA]a to germinate, although germination can be blocked under exogenous ABA incubation. Then, embryonic axes of soybean seeds, collected from 25 to >60 DAA, were an appropriate experimental model to establish cause-effect relationships between ABA and those possible metabolic effectors that participate on germination and are controlled by ABA. At the same time, these allow to focus the study on this principal organ, without considering the rest of seed organs that do not have a key role on germination. [ABA]a quantifications were performed by radioimmunoassay based on the use of the monoclonal antibody DBPA1. Molecular analyses were made in two regions from the embryonic axes, the extremes (plumule + radicle) and the elongation zone, EZ, into the hypocotyl, whose cells strictly experience the expansivo process and are, consequently, the main zone of study. We evaluated embryonic axes germination on distilled water and other solutions. The expansivo nature of germination was evaluated by osmotically restraining imbibition in Polyethylene glycol 8000 solutions (PEG). The aim of pH8 incubation was to inhibit the "acid growth" which is referred as the initial event responsible for the enlargement during germination. The ABA control on cell wall relaxing by avoiding the expansión and thus the embryonic axes enlargement was evaluated in ABA incubations. The molecular strategy was focused on identifying Expansin sequences, whose optimum activity at pH~4 is indicated on plant cell wall acid growth, thus being in consequence, primary responsible for the cell wall remodeling on EZ that defines the expansive process during germination. We evaluated Expansins on genomic DNA. After that, a fragment (EXPAI-like) was amplified and sequenced from the messenger RNA (mRNA) of germinated embryonic axes in distilled water, which presented a high homology with the EXP1 of soybean. Expression analyzes were performed by Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction in one step, semiquantitative (RT-PCR) and in two steps, quantitative and in Real Time (RT-qPCR). The results showed that EXPAI-like was mostly present in EZ, showing both a repression by ABA or pl-18, and induction in distilled water or PEG. Additionally, the presence of this transcript in EZ, still, without any incubation, determined that EXPAI-like is part of the storage biomolecules in soybean embryonic axes during its formation. Complementary studies showed that, in the presence of a transcriptional inhibitor (a- Amanitin), the embryonic axes germinated, although at lower rates and percentages than in distilled water; meanwhile they did not germinate when translation was inhibited in Cycioheximide, thus indicating that germination is possible from mRNA accumulated through seed development. On the other hand, an EXPAI-like expression progressively increasing in EZ from 25 - >60 DAA embryonic axes was measured, which was related to the [ABA]a decreasing through the development. Similarly, both the EXPAI-like increased and [ABA]a decreased during incubations in germination conditions for each age. According to these results, we postulate that EXPAI-like would participate as the decisive molecular events during soybean germination, allowing relaxation of cell wall necessary for ¡t to happen. The [ABA]a would operate repressing both EXPAI-like transcription and the molecular events downstream of ¡t.application/pdfspaopenAccessGerminación de las semillasSojaABAInhibidores del creciemintoÁcido abscísicodoctoralThesisEl autorAtribución-NoComercial-Compartirigual 2.5 Argentina (CC BY-NC-SA 2.5 AR)