Tubio, Gisela2021-09-272021-09-272020http://hdl.handle.net/2133/22179El diseño de bioprocesos para la producción de metabolitos fúngicos como las enzimas comprende operaciones unitarias para la producción, incluidas en el upstream, y en las de recuperación y purificación denominadas downstream. La optimación del bioproceso global permite minimizar el costo de producción. El hongo filamentoso Asperguillus niger es uno de los microorganismos más usado para la producción de enzimas hidrolíticas, debido a su capacidad de producir proteínas exógenas. En el marco del presente trabajo de tesis doctoral se planteó el desarrollo de un bioproceso de producción de enzimas del sistema xilanolítico, a partir de un subproducto de la industria harinera priorizando el empleo de reactivos biodegradables e inocuos y reutilizando los residuos generados para alcanzar un proceso sostenible. Como punto de partida del upstream del proceso, se realizó la caracterización de extractos enzimáticos obtenidos de cultivos fúngicos de A. niger, fermentaciones sumergidas y sólidas, efectuadas a partir de diferentes sustratos lignocelulósicos utilizados como única fuente de carbono. Se seleccionó el afrechillo de trigo, la cascarilla de soja y la harina de trigo como los más adecuados en comparación a otros nueve sustratos ensayados, para la producción de xilanasas. Mediante diseño estadístico experimental, se identificaron los factores que más afectaron al proceso productivo, permitiendo así optimizar las condiciones metodológicas y maximizar la concentración de enzimas xilanolíticas (EX) respecto de las celulolíticas (EC). El sistema optimizado mediante un diseño central compuesto empleando metodología de superficie de respuesta contiene 0,1 gramo de afrechillo de trigo sin tratamiento alcalino; 1 g/L de NaNO3, 29,09 mL de solución de cultivo a pH=6,50 incubándose a 30°C durante 4 días, y el extracto optimizado contiene una actividad especifica de enzimas xilanolíticas de 24 U/mg. El escalado de la fermentación optimizada, permitió obtener el extracto enzimático sin variación en la calidad ni cantidad de las EX, reutilizándose el sólido remanente en nuevos procesos fermentativos para la producción de biosurfactantes. Se caracterizó el secretoma optimizado de A. niger identificando las enzimas que lo componen; y evaluando los parámetros cinéticos de las EX del extracto, las que resultaron sensibles a la presencia de Cu2+, estables en un amplio rango de pH (3,00-9,00), con un tiempo de vida media superior a 120 días a temperaturas entre 20 y 30°C, no requiriendo del agregado de cosolutos para su estabilización. La eficiencia de las enzimas del EEO, se analizó mediante sacarificación de cascarilla de soja, corroborándose que el conjunto de enzimas hidrolíticas es altamente activo en la degradación de la hemicelulosa y celulosa de este residuo. Iniciando el downstream del proceso de obtención de EX fúngicas se caracterizaron tres diferentes técnicas de extracción, la tradicional precipitación con sulfato de amonio en la cual se obtuvo bajo rendimiento, la extracción líquido-líquido empleando sistemas bifásicos acuosos (SBAs) y finalmente cromatografía de intercambio iónico. En la extracción empleando SBAs se evaluaron sistemas formados por los polímeros de cadena flexible UCON y PEGs de pesos moleculares promedio 600, 1450, 2000 y 4600, como también las sales NaCit y KPi, la composición inicial, agregado de NaCl, la variación de la relación de volúmenes de fases y la cantidad de EEO. Se ensayó la extracción combinada y consecutiva de los sistemas UCON/NaCit y PEG/NaCit, siendo posible extraer los pigmentos producidos durante la fermentación en la fase superior de la extracción primaria del sistema UCON/NaCit. La fase inferior, donde se concentraron las proteínas del EEO, se utilizó para formar un nuevo sistema (extracción secundaria) formado por PEG1450 y NaCit en el cual se recuperaron en la fase superior las EX con una abundancia relativa del 66,1%. La combinación de ambos SBA permitió incrementar la capacidad separativa de las EX respecto de las EC, alcanzando un factor de purificación de 3,8 y un %REX del 80%, y recuperándose la sal citrato de sodio de la fase inferior para su reutilización en nuevos SBAs. Se evaluó a las enzimas purificadas por extracción combinada de los SBA y las del EEO, como aditivos enzimáticos en la elaboración de pan de harina de trigo. Las enzimas purificadas mediante SBA combinados mejoraron la estructura de la miga, el volumen, el piso y el corte del pan. El fraccionamiento de proteínas por cromatografía de intercambio iónico fue óptimo al emplear una columna Q Sheparosa XL, siendo el %REX de esta etapa de purificación de 99,2% y factor de purificación de 2,9. Finalmente, se planteó una estrategia integrada para la bioseparación de las EX combinando la extracción consecutiva UCON15%P/P / NaCit7%P/P y PEG15,5%P/P / NaCit13,6%P/P con un Vsup/Vinf= 1 a pH 5,2 y temperatura de 22°C; con cromatografía aniónica utilizando la columna Q Sheparosa XL a flujo de 1mL/min, volumen de inyección de 100µL, gradiente de elución en 2 minutos y tiempo de lavado 1 de 5 minutos. El bioproceso diseñado fue eficiente para la producción y purificación de EX de A. niger, con un rendimiento total de 79,9% un factor de purificación de 11 y actividad xilanolítica de 0,49 U/ml correspondientes a endo-β-1,4-xilanasa B y C, las que se encuentran libres de las enzimas celulolíticas, lo cual permitiría su utilización en la industria papelera en reemplazo de agentes tóxicos que se utilizan para el blanqueo de la pasta de papel.application/pdfspaembargoedAccessProducción de enzimasIndustria harineraBioprocesosMetabolitos fúngicosAsperguillus nigerEnzimas hidrolíticasdoctoralThesisTaddia, AntonelaAtribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentina (CC BY-NC-ND 2.5 AR)