Evaluación de diferentes métodos de monitoreo para el diagnóstico de virus de Influenza A en granjas porcinas - (:unkn) unknown (Universidad Nacional de Rosario, 2022)
RESUMEN En los cerdos, los virus de influenza A (VIA) provocan enfermedad respiratoria y tienen implicancias en Salud Pública. En nuestro país, la infección por VIA en las granjas porcinas es endémica y la vigilancia sanitaria resulta esencial para su detección y control. Para esto, se requieren herramientas de diagnóstico sensibles, técnica y económicamente convenientes para el sector productivo y respetuosas del bienestar animal. El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad de diferentes métodos de monitoreo para el diagnóstico de la infección por VIA en criaderos porcinos intensivos confinados infectados naturalmente, bajo el manejo de los sistemas productivos argentinos y de acuerdo con las condiciones de procesamiento locales. Inicialmente se puso a punto una técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR) para detección de VIA. Se evaluaron dos productos comerciales para la extracción de ARN en una muestra control positivo con alta concentración viral y en muestras de fluido oral, el efecto de dilución del templado de ARN y la concentración de la mezcla de enzimas en la RT-PCR sobre la capacidad de detección de VIA en muestras de fluido oral. En granjas porcinas intensivas naturalmente infectadas por VIA se registró la presencia de signos clínicos y se recolectaron muestras de secreción nasal y fluido oral, en algunos casos se incluyeron muestras para histopatología e inmunohistoquímica (IHQ) y de sueros para detección de anticuerpos mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) comercial. Se evaluó el acuerdo entre la presencia de signos y detección de VIA mediante los diferentes métodos de muestreo, en forma global y estratificando por grupos etarios o categorías animales estudiadas y por granja analizada. En salas de maternidad de granjas con manifestaciones clínicas compatibles con infección por VIA en lechones pre-destete se recolectaron muestras de secreción orofaríngea de lechones y de la piel de la ubre de las cerdas mediante gasas mamarias. Además, en una granja con infección natural por influenza se llevó a cabo la recolección de muestras de bioaerosoles mediante un colector ciclónico líquido. Mediante la RT-PCR empleada se logró la detección de VIA en diferentes tipos de muestras, hubo concordancia excelente entre los dos productos comerciales empleados para la extracción de ARN. La dilución del templado de ARN y el uso del doble de concentración de enzimas de la mezcla de RT-PCR sobre el templado de ARN puro o diluido no mejoraron la sensibilidad de la RT-PCR. En la detección de VIA, las tasas de acuerdo entre signos clínicos y resultados de RT-PCR en muestras de secreción nasal y fluido oral fueron diferentes de acuerdo con el grupo etario o categoría y granja estudiada: máximas en cerdos de 21-34 ddv, algo menores en cerdos de 35-70 ddv y bajas o nulas en cerdos de 71-203 ddv. Si bien hubo acuerdo estadísticamente significativo entre la detección de ARN de VIA mediante RT-PCR de muestras de secreción nasal y muestras de fluido oral, las muestras de fluido oral fueron comparativamente más sensibles, fáciles de obtener, no invasivas ni estresantes para los animales y más económicas que las muestras de secreción nasal. No hubo asociación estadísticamente significativa entre la detección de anticuerpos contra VIA por ELISA, presencia de signos clínicos y la detección de VIA por RT-PCR de muestras de secreción nasal y/o fluido oral. En las muestras de pulmón, la lesión histopatológica observada más frecuentemente fue el infiltrado mononuclear difuso peribronquial y la técnica de inmunohistoquímica, con una tasa de detección del 100%, permitió confirmar la presencia de VIA en cortes con lesiones histopatológicas inespecíficas e incluso con cierto grado de autólisis. En salas de maternidad, el hisopado orofaríngeo permitió la detección de VIA en lechones con y sin manifestaciones clínicas, aunque no detectamos ARN de VIA en muestras de gasa mamaria. Por otro lado, los muestreos de bioaerosoles no fueron útiles para la detección de ARN de VIA en el caso de una granja endémica y condiciones de crianza e instalaciones de nuestro país. Frente a la endemicidad de VIA en cerdos, sería necesario realizar estudios sistemáticos que permitan conocer su origen y evolución para producir inmunógenos de mayor eficacia para el control o eliminación de este agente de las granjas.

SUMMARY Influenza A viruses (VIA) cause respiratory disease in pigs and have public health implications. In swine farms in Argentina, VIA infection is endemic and health surveillance programs for its detection and control are essential. In this sense, sensitive diagnostic tools are needed, where animal welfare and technical and economical suitability for the swine industry need to be considered. The aim of this study was to evaluate the usefulness of different monitoring methods for the diagnosis of VIA infection in naturally infected confined swine farms, under the Argentinian production systems management practices and according to the local processing conditions. Initially, an reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) technique for VIA detection was developed. Two commercial products for RNA extraction were evaluated and compared using a positive control with high viral concentration sample and oral fluid samples. Moreover, an RNA template dilution and the RT-PCR enzyme mixture concentration effects were also evaluated for the VIA detection from oral fluid samples. In intensive, naturally VIA infected swine farms, the presence of clinical signs was recorded, and nasal secretion and oral fluid samples were collected. In some cases, tissue samples and serum samples were included, for histopathology and immunohistochemistry (IHC) and for commercial ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) antibody detection, respectively. The concordance between the presence of clinical signs and VIA detection between the different sampling methods was evaluated; first globally and then stratifying by age, by animal categories and by farm. Oropharyngeal secretion samples from piglets and udder skin wipes from sows were collected from farrowing units where clinical signs consistent with VIA infection in pre-weaning piglets were detected. In addition, bioaerosol samples were collected from a naturally VIA infected farm using a liquid cyclonic collector. RT-PCR for VIA detection in different sample types was achieved. There was excellent concordance between the two commercial products used for RNA extraction. The RNA template dilution and the use of twice the enzyme concentration of the RT-PCR mixture on pure or diluted RNA template did not improve the RT-PCR sensitivity. The agreement rates between clinical signs records and results from RT-PCR for VIA detection in nasal secretions and oral fluid samples were different according to the age, category and farm studied: maximum in 21-34 day-old pigs, somewhat lower in 35-70 day-old pigs and low or none in 71-203 day-old pigs. While there was statistically significant agreement between VIA RNA detection by RT-PCR from nasal secretion and oral fluid samples, oral fluid samples were comparatively more sensitive, easier to obtain, non-invasive and non-stressful for animals, and less expensive than nasal secretion samples. There was no association between antibodies against VIA detection by ELISA, clinical signs presence and VIA detection by RT-PCR from nasal secretion and/or oral fluid samples. The most frequently detected histopathological lesion in lung samples was the peribronchial diffuse mononuclear infiltrate. The 100% detection rate of the immunohistochemistry technique allowed the confirmation of VIA antigen in samples with nonspecific histopathological lesions, and even with a certain degree of autolysis. In farrowing units, VIA RNA was detected in oropharyngeal swab samples from piglets with/without clinical signs, whereas it was not detected in sow udder skin wipes. On the other hand, VIA RNA detection was not possible in bioaerosol samples collected from an endemic Argentinian farm under the local particular breeding and facilities characteristics. Considering the endemicity of VIA in swine, it would be necessary to carry out systematic studies to know local VIA origin and evolution to produce more efficient immunogens for VIA farm control and/or elimination.
Keywords: CERDOS; INFLUENZA; RT-PCR; FLUIDO ORAL; SECRECIÓN NASAL; INMUNOHISTOQUÍMICA; HISTOPATOLOGÍA