Zanor, María Inés2019-08-162019-08-162017-04-18http://hdl.handle.net/2133/15792Una de las funciones más cruciales de las células vegetales es su capacidad para responder a las fluctuaciones de su ambiente (Grene, 2002) y el estrés ambiental representa el factor limitante más importante para la productividad vegetal y el rendimiento de las cosechas (Allen, 1995). Aproximadamente el 40% de las proteínas codificadas en genomas eucariotas son PFD (Horan y col., 2008). En Arabidopsis, aún se desconoce la función de cada uno de sus genes, a pesar de que su genoma fue secuenciado hace más de 15 años (Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Es por esto que uno de los principales desafíos de la biología moderna es poder dilucidar la función de cada uno de ellos. En nuestro laboratorio se ha analizado en forma global el transcriptoma de Arabidopsis utilizando chips de Affymetrix (Gene Chip), detectando los cambios de expresión génica luego de someter plántulas a estrés oxidativo mediante la aplicación del herbicida MV durante 2 h (Scarpeci y col., 2008). La aplicación del herbicida durante un tiempo corto favorece la detección de genes de respuesta temprana, los cuales se espera que codifiquen para proteínas regulatorias o de señalización tales como proteinquinasas o proteinfosfatasas y FT. Como resultado se identificaron 30 genes que codifican para FT, 23 que codifican para señalización y 68 de función no asignada, de los cuales se seleccionaron tres para caracterizar en este trabajo: AtTX24 (At5g44910), AtERF112 (At2g33710) y FITNESS (At1g07050). Al inicio de esta tesis doctoral, no había ningún dato biológico reportado respecto a localización subcelular, expresión tejido y órgano específico, y la caracterización fenotípica, bioquímica y fisiológica de líneas con niveles alterados en los tres genes seleccionados para su estudio que pudieran aportar datos respecto a su posible función biológica. Durante este trabajo, se analizaron los efectos de aumentar o disminuir los niveles de expresión de los mismos en relación a plantas controles de Arabidopsis. Por otro lado, se generaron líneas transgénicas de fusión a genes reporteros que permitieron determinar la localización subcelular de los productos génicos de AtERF112 y FITNESS, y el patrón de expresión tejido-específico para los tres genes en estudio. Con los resultados obtenidos se concluye que:  La proteína AtTX24, es una proteína que pertenece a la familia de proteínas TX por presentar un dominio TIR y un dominio X. Se expresa en raíces, hidátodos y sistema vascular de la hoja. Plantas de Arabidopsis con niveles disminuidos de AtTX24 mostraron un fenotipo de mayor producción de raíces y, aunque no se observaron diferencias en la arquitectura y área de la roseta, los tallos fueron de mayor longitud. A su vez mostraron menores niveles de chl a y carotenoides, y presentaron menores niveles de H2O2 basales que la línea control WT. En cuanto a situaciones de estrés abiótico, la disminución de AtTX24 generó plantas más tolerantes al estrés salino aunque, la tolerancia observada no pudo relacionarse con una acumulación diferencial del metabolito Pro al menos a los tiempos analizados (2,5 h y 25 h). Sin embargo, la fuerte expresión del gen AtTX24 en raíces sugiere que podría participar en procesos relacionados a estrés abiótico a ese nivel. Respecto al estrés oxidativo, las plantas con niveles reducidos de AtTX24 mostraron menores señales de daño luego de la aplicación de MV, lo que concuerda con la menor acumulación de H2O2 observada luego de este tratamiento. Esto podría indicar que en la línea mutante attx24 se generan menos o se detoxifican más eficientemente las ERO generadas durante el estrés aplicado. Niveles aumentados de AtTX24 se relacionan con una mayor producción de hojas y las mismas permanecen verdes por más tiempo que en la línea control WT y con mayores niveles de chl a y carotenoides. Un gran número de proteinquinasas se co-expresan positivamente con AtTX24, las cuales habitualmente están involucradas en cascadas de transducción de señales, lo que indicaría que este gen participar en procesos de señalización relacionados a estrés abiótico, específicamente aquellos que tienen un componente salino y oxidativo.  La proteína AtERF112, codificada por el gen At2g33710, pertenece al grupo X de la familia de FT ERF y se acumuló predominantemente en el compartimento nuclear de las células. Se expresó en cotiledones, hidátodos, sistema vascular de las hojas, flores, anteras, estigma y polen. La expresión de AtERF112 es ampliamente detectada en diferentes tejidos de la planta, por lo que este gen podría ejercer su rol en distintos órganos de la planta afectando la función de fitohormonas u otras señales de larga distancia no identificadas. Niveles disminuidos de AtERF112 no generan cambios fenotípicos al compararlas con plantas controles tanto en condiciones normales de crecimiento como en condiciones de estrés abiótico. Niveles elevados de AtERF112 produjeron plantas de Arabidopsis con alteraciones en su arquitectura. Las líneas presentaron un mayor número de hojas e inflorescencias con pérdida de la dominancia apical en condiciones normales de crecimiento. Cuando se les aplicaron diferentes estreses estas líneas resultaron sensibles a la deficiencia de agua, al estrés salino, osmótico y a la aplicación exógena de ABA y glucosa. Todo esto sugiere que las líneas sobreexpresantes muestran un fenotipo asociado a carencia de ABA lo cual puede ser el resultado de la disminución de su síntesis, del aumento de su degradación o de insensibilidad a esta hormona. AtERF112 podría actuar en alguna vía de transducción de señales afectando la respuesta al estrés, modificando en Arabidopsis la respuesta a ABA de la planta.  La proteína FITNESS posee un único dominio CCT y pertenece a la familia CMF, donde ha sido clasificado como AtCMF3. Se localizó en el compartimento nuclear de las células, lo que indica que podría participar en procesos regulatorios. Se expresó en cotiledones, hojas jóvenes, hojas completamente expandidas y en los sépalos de las flores. Niveles elevados de FITNESS provocaron en Arabidopsis un fenotipo de desarrollo alterado. Las líneas presentaron tamaño reducido y hojas de color verde pálido, con lesiones espontáneas en los bordes y de forma redondeadas e hiponásticas. Las mutantes fitness presentaron un fenotipo casi indistinguible, en cuanto a morfología, de las plantas control WT, aunque en estadios avanzados de desarrollo, sus hojas se vieron ligeramente más estrechas que las plantas control WT debido a una mayor curvatura hacia abajo de sus bordes y se observó que las mismas producen un mayor número de semillas en relación al control WT, lo cual se relacionó con un valor de NPQ significativamente menor en relación al control WT, lo que indicaría que estas plantas llevan adelante una fotosíntesis más eficiente. Los niveles alterados de FITNESS provocaron también cambios metabólicos y, bioquímicos en las plantas de Arabidopsis. Altos niveles de FITNESS se relacionaron con una alta producción ERO, lo cual depende de la duración del día y genera lesiones en los bordes de las hojas. Las líneas FITNESS presentaron alteraciones en las vías de fotorrespiración. Utilizando el marcador fluorescente H2DCF-DA se pudo corroborar que los niveles de ERO acumulados en las distintas líneas dependen de los niveles de expresión de FITNESS y adicionalmente se observó que la acumulación de ERO en las líneas FITNESSox presenta un patrón compatible con localización peroxisomal. Además, FITNESS provoca cambios en los niveles de AS y las mutantes fitness poseen tolerancia aumentada al estrés oxidativo. Se ha postulado que JUB1 es un regulador central de los niveles de H2O2 y prepara a las plantas para el próximo estrés a través de una red regulatoria de genes (Wu y col., 2012). En las plantas fitness y FITNESSox, la expresión de JUB1 fue aumentada y disminuida, respectivamente. Este dato sugiere que FITNESS regularía negativamente la expresión de JUB1, actuando corriente arriba de JUB1 en una vía regulatoria de estrés ambiental. Cuando FITNESS está ausente, la expresión de JUB1 aumenta y las plantas están mejor preparadas para enfrentar el estrés oxidativo, como se observó en las plantas fitness.application/pdfspaembargoedAccessEstrés OxidativoGenes de Función DesconocidaArabidopsisdoctoralThesisOsella, Ana VirginiaAtribución – No Comercial – Sin Obra Derivada (by-nc-nd): No se permite un uso comercial de la obra original ni la generación de obras derivadas https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/