Sánchez Pozzi, Enrique Juan2021-08-302021-08-302020http://hdl.handle.net/2133/21793TNFα es una citoquina cuyos niveles intracelulares se encuentran elevados en patologías asociadas a colestasis. La internalización endocítica de Mrp2 (proteína asociada a resistencia a multidrogas 2), un transportador canalicular de aniones orgánicos que regula la excreción de drogas clínicamente relevantes, es un fenómeno que ocurre en diversas enfermedades inflamatorias del hígado donde se ha establecido que las citoquinas actúan como mediadoras. Sin embargo, los mecanismos intracelulares implicados que median este fenómeno no han sido estudiados. El objetivo de este proyecto de Tesis doctoral es caracterizar la internalización de Mrp2 inducida por TNFα y estudiar el rol de diferentes proteínas descriptas en otros modelos de colestasis, tales como ERK1/2, PI3K, PKC y especies reactivas del oxígeno (ROS), que podrían estar modulando las cascadas de señalización intracelulares implicadas en el proceso. Utilizando un modelo in vitro de duplas de hepatocitos de rata, encontramos que TNFα (6,25 pg/ml) indujo una disminución en la actividad de Mrp2 estimada mediante la acumulación del sustrato glutatión metilfluoresceína (GMF) en la vacuola canalicular, efecto que fue acompañado por la internalización del transportador desde la membrana canalicular hacia compartimientos subapicales. La inhibición de MEK1/2 (proteína cascada arriba de ERK1/2) previno parcialmente los efectos de TNFα en la alteración funcional y la internalización endocítica de Mrp2. Dichos efectos fueron validados en el modelo de hígado aislado y perfundido donde la alteración de la actividad y deslocalización del transportador provocada por el tratamiento con TNF (120 pg/100 g p.c) se previene en presencia del inhibidor. El tratamiento con scavengers de ROS tales como vitamina C y manitol, previno la disminución en la capacidad de transporte de Mrp2 inducida por TNFα y la fosforilación de ERK1/2. A su vez, apocinina, un inhibidor de la proteína NADPH oxidasa (NOX), previno el aumento de la producción de ROS intracelulares y la fosforilación de ERK1/2 provocados en respuesta al tratamiento con la citoquina. Esto indicaría que TNFα activa una vía de señalización que involucra la activación de NOX y la subsecuente liberación de ROS activan MEK1/2-ERK1/2 modulando la alteración funcional de Mrp2. Por otro lado, inhibidores de la proteína quinasa C (PKC), revirtieron parcialmente los efectos de TNFα en la alteración funcional del transportador. A su vez, el tratamiento en conjunto de los inhibidores de PKC y MEK1/2 provocó efectos de sumación en la acumulación de GMF, no así el tratamiento conjunto de inhibidores de PKC y el agregado de scavengers o apocinina. Estos resultados indican que PKC también se encuentra mediando los efectos de TNFα sobre la actividad de Mrp2 ejerciendo sus efectos en una vía de señalización distinta de MEK1/2-ERK1/2 pero dependiente de los ROS generados por NOX. Otra vía que participa del fenómeno es la vía PI3K-Akt. Mediante el uso de inhibidores se observó una prevención parcial tanto en la disminución de la actividad de Mrp2 como en el proceso de internalización del transportador inducidos por la citoquina tanto en el modelo de duplas aisladas de hepatocitos como en hígado aislado y perfundido. El tratamiento con vitamina C y el inhibidor de MEK1/2 en simultáneo con el inhibidor de PI3K demostraron una protección mayor en la capacidad de Mrp2, sugiriendo que la proteína participa en una vía distinta de señalización. Las vías y proteínas descriptas en el proceso podrían ser dianas para nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de colestasis inducida por procesos inflamatorios. La internalización que produce una disminución de la capacidad de transporte de Mrp2 podría alterar la disposición y eliminación de drogas, lo que provocaría un aumento de toxicidad de las mismas en aquellos pacientes que sufren enfermedades inflamatorias del hígado.application/octet-streamspaembargoedAccessColestasisMrp2TNF-αdoctoralThesisCiriaci, NadiaUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial 2.5 Argentina