Busi, María Victoria2025-06-302025-06-302024https://hdl.handle.net/2133/29752El hierro y el azufre son esenciales para todos los organismos. Estos elementos forman los clusters Fe-S que están presentes como cofactores en numerosas proteínas y complejos proteicos relacionados con procesos clave en las células. Se ha descripto que en las mitocondrias de levaduras, humanos y plantas es la proteína frataxina (FH) quien cede los átomos de Fe en el proceso de biosíntesis de los clusters Fe-S. Esta proteína también ha sido asociada con el control celular redox, la desintoxicación de Fe y la protección contra el estrés oxidativo. Frataxina es una proteína ampliamente distribuida y conservada en la naturaleza. Aunque se han realizado muchos estudios en humanos y levaduras, hay pocos informes sobre la caracterización de frataxina en organismos fotosintéticos. El mecanismo de ensamblado de los complejos Fe-S está relacionado con el metabolismo de lípidos. Las rutas metabólicas de carbohidratos y lípidos están también relacionadas ya que existe una competencia entre la síntesis de lípidos y almidón. En condiciones de estrés, el principal precursor de la síntesis de TAGs es el glicerol-3-fosfato (G3P), que se produce por catabolismo de la glucosa en el citosol (glucólisis). La degradación del almidón provee metabolitos para la producción de acetil-CoA, el cual es el precursor para la síntesis de ácidos grasos. Así en algunos casos una disminución de la degradación de almidón, podría bloquear la síntesis de lípidos. Otros autores informan que, en la mayoría de las microalgas, el almidón se acumula como fuente primaria de energía y reserva de carbono (C), mientras los lípidos sirven como un almacenamiento secundario. Teniendo esto en consideración nos planteamos estudiar si la modificación en las vías de ensamblaje de los complejos Fe-S afecta la producción de lípidos y otros componentes de las células. El conocimiento generado podría aplicarse al diseño de biomasa con fines energéticos y/o alimenticios. El primer objetivo de esta tesis fue realizar un análisis bioinformático e identificación de proteínas implicadas en la síntesis de grupos Fe-S en clorófitas. La búsqueda reveló una alta conservación de genes y proteínas involucrados en la síntesis de complejos Fe-S en las mitocondrias de algas. Muchas especies mostraron la presencia de múltiples genes y/o proteínas homólogas que pertenecerían a la vía ISC. En cambio, se observó una sola isoforma de las proteínas de la vía CIA en la mayoría de las algas analizadas, a excepción de Chlamydomonas reinhardtii. Como segundo objetivo de este trabajo se caracterizaron cepas de C. reinhardtii sobreexpresantes en frataxina. Para ello se obtuvieron cepas transformantes mediante electroporación y las mismas fueron denominadas CrFH1 (C. reinhardtii sobreexpresante de FH en citoplasma) y CrCOXFH15 (C. reinhardtii sobreexpresante de FH en mitocondria). Se observó que las algas que sobreexpresan frataxina presentan mayor crecimiento que las algas WT en presencia de Fe3+ y H2O2 agregados al medio. Estos resultados muestran que los mayores niveles de frataxina disminuyen la sensibilidad al estrés generado por la presencia de agentes oxidantes, evidenciando que frataxina cumple un rol protector frente al estrés oxidativo en algas. Además se observó que la línea transformante CrCoxFH15 acumula mayor cantidad de clorofila a, clorofila b y proteínas durante la fase exponencial con respecto a las líneas CrWT y CrFH1. Durante la fase estacionaria, se observó también un marcado aumento en la producción de triglicéridos en la línea sobreexpresante CrCoxFH15, demostrando que la sobreexpresión de frataxina dirigida a mitocondria incrementa la acumulación de lípidos en C. reinhardtii, reforzando la evidencia de la participación de frataxina en el metabolismo lipídico. El análisis de metabolitos intracelulares realizados por CG EM mostró un aumento significativo en el contenido alanina glicina, serina, prolina y de los aminoácidos esenciales isoleucina y leucina en las lineas CrCoxFH15 y CrFH1 respecto a la línea CrWT. Los valores son mayores cuando frataxina es expresada en mitocondria. Esto convierte a la línea CrCoxFH15 en una candidata para la obtención de productos utilizados como suplementos nutricionales para alimentación tanto animal como humana y bioestimulantes. Posteriormente, se evaluó el efecto de las líneas CrWT, CrFH1 y CrCoxFH15 sobre la germinación de semillas de soja. Los resultados mostraron que las semillas preincubadas en los extractos de algas transformantes presentaron brotes de mayor grosor y longitud, lo cual nos permite suponer que el mayor contenido de aminoácidos en las líneas transformantes aportaría una cantidad extra de nitrógeno que podría ser utilizada durante el desarrollo de la planta. Por otro lado, se evaluó también la transformación de algas las algas modelo N. gaditana y Chlorella sp. mediante electroporación y transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, pero no se logró la obtención de algas transformantes por ninguno de los métodos aplicados. Los estudios in silico realizados para llevar a cabo el tercer objetivo de este trabajo mostraron que las frataxinas de Ectocarpus siliculosus (EctsiFH), Nannochloropsis gaditana (NangaFH) y Chlorella vulgaris (ChlspFH) contienen un dominio frataxina conservado, confirmando así la gran similitud estructural que contienen los homólogos de frataxina entre sí. En los modelados obtenidos, se pudo observar que EctsiFH, NangaFH y ChlspFH poseen el dominio característico αβ sandwich de la familia de frataxinas. El análisis de homología de residuos involucrados en la unión a hierro muestra que existe un alto porcentaje de residuos conservados (62,5% para EctsiFH, 37,5% para NangaFH y 43,75% para ChlspFH) respecto a la CyaY de E.coli. Estas observaciones permiten suponer que estas proteínas son capaces de unir Fe. Al expresar EctsiFH en células de E. coli se observó que las mismas tenían una mayor capacidad de crecimiento en presencia de H2O2 Cd, Zn y Ni que el observado para las células wt. Este mismo comportamiento fue mostrado por células de E. coli que fueron suplementadas con NangaFH en presencia de H2O2 Cu, Zn, Cr. A diferencia de las otras dos, ChlspFH expresada en E. coli no aportó ninguna ventaja en presencia de H2O2, pero sí con Cu, Zn y Ni. Además, los experimentos in vitro demostraron que ChlspFH atenúa la reacción de Fenton en un 23% respecto al control (ausencia de ChlspFH), mientras que EctsiFH y NangaFH atenúan en menor proporción la reacción oxidativa. Estos resultados permiten suponer un rol protector de frataxina contra agentes oxidantes y de esta forma, su presencia podría atenuar los efectos del daño oxidativo.esembargoedAccessHierroAzufreAlgastesisMarchetti Acosta, Noelia SoledadUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 (Argentina)