Krapf, Darío2022-09-122022-09-122022http://hdl.handle.net/2133/24387Los espermatozoides de mamíferos recién eyaculados no tienen la capacidad de fecundar al óvulo. Primero deben atravesar una serie de eventos fisiológicos conocidos como “capacitación”. Este proceso resulta en la adquisición de capacidad para sufrir reacción acrosómica (RA) al enfrentarse a un inductor como la progesterona (Pg), y un cambio en el patrón de motilidad denominado hiperactivación. A nivel molecular, durante la capacitación se dan numerosos eventos entre los cuales se encuentran la activación rápida de la proteína quinasa A (PKA) y la hiperpolarización del potencial de membrana (Em), en donde el interior celular se vuelve más negativo, comparado con el exterior. En humanos, trabajos previos han reportado la existencia de la hiperpolarización del Em asociada a la capacitación, pero sólo en forma cualitativa mediante citometría de flujo o el uso de electrofisiología. Sin embargo, en dichos trabajos no se determinó el cambio en el Em a nivel cuantitativo durante el proceso de capacitación. Teniendo en cuenta esto, en este trabajo nos propusimos optimizar un método para evaluar este parámetro, con el objetivo de estudiar su rol en la capacitación del espermatozoide. Utilizamos un ensayo de fluorimetría poblacional para medir el Em que permite la obtención de un valor absoluto ya que se emplea una curva de calibración interna por condición. Habiendo estandarizado la medición del Em, se evidenció una hiperpolarización de la membrana plasmática significativa en condiciones capacitantes entre muestras normospérmicas; no siendo el caso para muestras no normospérmicas. Esto sugiere que la hiperpolarización se relaciona estrechamente con el estado fisiológico del espermatozoide. En cuanto al rol biológico de la hiperpolarización, se encontró una correlación entre los valores de Em de espermatozoides capacitados y el porcentaje de RA inducida con Pg, donde muestras más hiperpolarizadas tuvieron mayores porcentajes de RA inducida. Sumado a esto, observamos una clara tendencia a la hiperactivación entre aquellas muestras hiperpolarizadas. Estos datos implican que la hiperpolarización de la membrana plasmática juega un papel importante en el proceso de capacitación. Para determinar si la hiperpolarización está asociada a la capacidad fecundante de espermatozoides humanos, medimos el Em de muestras de pacientes destinadas a tratamientos de fecundación in vitro (FIV). Demostramos que muestras espermáticas con porcentajes de FIV exitosos exhiben hiperpolarización del Em con la capacitación, no siendo el caso para aquellas muestras con menores tasas de FIV. Además, se encontró una correlación significativa entre los valores de Em de muestras capacitadas y las tasas de FIV. Mediante un análisis de curva ROC concluimos que el Em de muestras capacitadas es un buen parámetro para discriminar entre tasas de FIV exitosas y no exitosas. Finalmente, realizamos el seguimiento del Em en un grupo de 10 donantes durante 5 semanas. Llegamos a la conclusión de que dicho parámetro es homogéneo y que podría ser incluido en el análisis previo que se realizan los pacientes destinados a tratamientos de reproducción asistida. Para terminar, nos propusimos evaluar los mecanismos moleculares por los cuales el espermatozoide humano alcanza la hiperpolarización asociada a la capacitación. Teniendo en cuenta los resultados previos de nuestro laboratorio en el modelo murino, nos planteamos estudiar el posible rol que cumple PKA en la modulación del Em en el espermatozoide humano. Nuestros experimentos mostraron resultados opuestos a los encontrados en ratón ya que, al inhibir el eje cAMP/PKA, se evidenció una mayor hiperpolarización en lugar de una despolarización celular. Esto sugiere que la regulación del proceso de capacitación en espermatozoides humanos comprende una señalización diferencial de los canales iónicos involucrados que no se ajusta a lo demostrado en el modelo murino. En conclusión, nuestros resultados aportan una integración del conocimiento básico de la capacitación espermática humana para potencialmente contribuir a un manejo más personalizado de los pacientes destinados a tratamientos de reproducción asistida.application/pdfspaembargoedAccessCapacitaciónEspermatozoidePotencial de membranaFecundación in vitrodoctoralThesisBaró Graf, CarolinaUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial-CompartirIgual 2.5 Argentina (CC BY-NC-SA 2.5 AR)