Roma, Marcelo Gabriel2021-08-282021-08-282019http://hdl.handle.net/2133/21783El lipopolisacárido (LPS) de la pared de las bacterias Gram negativas (endotoxina) induce colestasis inflamatoria al alterar la expresión, función y localización de los transportadores involucrados en la formación de bilis, por ejemplo, la bomba exportadora de sales biliares (Bsep) y la proteína asociada a la resistencia a multidrogas 2 (Mrp2). No hay hasta el momento opciones terapéuticas específicas para esta enfermedad. El ácido ursodesoxicólico (AUDC) es la terapia de primera elección en la mayoría de las patologías colestásicas humanas. Esta sal biliar posee amplias propiedades hepatoprotectoras. 1) Es un ligando de activación de PXR y FXR, dos receptores nucleares responsables de sostener elevada la expresión de Mrp2 y Bsep. 2) Favorece la reinserción de transportadores canaliculares a su dominio de membrana que han sido endocitados por la injuria colestásica. 3) Puede contrarrestar la inflamación y el daño hepático inducido por ácidos biliares, a través de múltiples mecanismos. A pesar de su amplia utilización terapéutica, la eficacia del AUDC en la colestasis por endotoxemia aún no se ha evaluado, y este fue uno de los objetivos de este trabajo de tesis. Para ello, ratas Wistar macho se dividieron en 3 grupos experimentales: 1) Grupo Control: Se le administró por 5 días el vehículo del AUDC intraperitoneal (i.p.). 2) Grupo LPS: Se le administró el vehículo del AUDC por 5 días i.p. y LPS, en dosis de 4 mg/kg/día i.p., a las 8 am de los últimos 2 días, aplicándose una dosis extra de 2 mg/Kg i.p. a las 8 pm del último día antes de la cirugía. 3) AUDC+LPS: Recibió AUDC durante 5 días (25 mg/ Kg/día, i.p.), y los últimos dos días, LPS como se describió para el grupo anterior. Luego del tratamiento, se evaluó la fosfatasa alcalina (ALP) plasmática, el flujo biliar (FB), la velocidad de excreción de sales biliares (SB) (VESB) basales y estimulada por la SB sustrato de Bsep taurocolato (TC), la velocidad de excreción de glutatión total (VEGSH) (sustrato de Mrp2) y la expresión y localización de las proteínas hepáticas Bsep y Mrp2, mediante microscopía confocal. Los niveles de ARNm de ambos transportadores se evaluaron mediante Real-time PCR. Las citoquinas proinflamatorias (IL-6 y TNF-α) se midieron en plasma mediante ELISA. Nuestros resultados mostraron que el AUDC atenuó la liberación de ALP a plasma inducida por LPS y el impedimento en la excreción de los sustratos de Bsep, lo cual fue evaluado a través de la determinación de la velocidad de excreción de TC. Esto se asoció con una mejor expresión de Bsep tanto a nivel del ARNm como de la proteína, y con una apropiada localización del transportador en la membrana plasmática. El AUDC no logró reducir el aumento de las citoquinas proinflamatorias en plasma ni la disminución en la expresión y función de Mrp2 inducidos por LPS. En conclusión, el AUDC protege al hepatocito contra el efecto deletéreo de las SB acumuladas por la falla secretora inducida por LPS. Esto fue debido a una mejora en la síntesis de Bsep y una mejora en la estabilidad en la membrana de los transportadores sintetizados de novo. Debido a los efectos limitados del AUDC como agente terapéutico frente a la colestasis por LPS, particularmente su incapacidad para mejorar la función de Mrp2, decidimos evaluar otros fármacos con potencialidad para contrarrestar la patología por mecanismos diferentes. Se evaluó, consiguientemente, la espironolactona (SL), un ligando de PXR que se sabe está implicado en la homeostasis de SB y regula positivamente la expresión de Mrp2. Se han descripto también propiedades anti-inflamatorias de la SL en otros modelos. Para ello, ratas Wistar macho se dividieron en 3 grupos experimentales: 1) Grupo Control: Recibieron el vehículo de la SL por 3 días i.p. 2) Grupo LPS: Se administró a las 8 am de los últimos 2 días, en dosis de 2,5 mg/Kg/día i.p., más una dosis, de 1,5 mg/kg i.p., a las 8 pm del último día. 3) Grupo SL+LPS: Se administró SL por 3 días, en dosis de 83,3 mg/ Kg/día, i.p., y los últimos dos días LPS, como se describió para el grupo anterior. Luego, se evaluó el FB, la VESB basales y post estímulo con TC, la VEGSH, y de un sustrato exógeno del transportador Mrp2, la dibromosulfoftaleina (DBSF). Se determinaron también los niveles de ARNm y de las proteínas Mrp2 y Bsep en hígado, mediante Real-time PCR y Western blot, respectivamente. Asimismo, se analizó la localización de los transportadores por inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal. Se determinaron los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en plasma mediante kits ELISA. Nuestros resultados muestran que la SL mejoró el FB. Además, mejoró la función y expresión, tanto a nivel del ARNm como de la proteína de Mrp2 y su localización en la membrana canalicular en ratas tratadas con LPS. No se observaron mejoras en la función de Bsep en los animales co-tratados, pero sí una mejora en la localización del transportador en membrana. Por otro lado, la SL no previno la elevación de las citoquinas en plasma. Inferimos que inductores de PXR podrían presentar efectos beneficiosos complementarios a los del AUDC, contrarrestando la disminución del flujo biliar inducida por LPS a través de mejorarar la excreción biliar de glutation vía inducción de Mrp2. Como conclusión final, nuestros resultados, muestran complementariedad terapéutica en los pretratamientos con AUDC y SL, sugiriendo que sería de relevancia evaluar posibles combinaciones de dichos tratamientos, como un modo de alcanzar una respuesta terapéutica más completa en esta patología.application/pdfspaembargoedAccessColestasis inducida por lipopolisacáridosÁcido ursodesoxicólicoEspironolactonaTransportadores hepatocelularesÁcidos biliaresdoctoralThesisRazori, María ValeriaUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial 2.5 Argentina (CC BY-NC 2.5 AR)