β-Lactamasas: abordaje de su evolución clínica y desarrollo de inhibidores
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2021
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Resumen
Los antibióticos son uno de los grandes hitos que permitieron el desarrollo de la
medicina moderna, junto con las vacunas y la mejora en las condiciones de higiene. Sin
embargo, su efectividad está siendo fuertemente amenazada por la resistencia bacteriana,
a tal punto que el CDC ya ha anunciado el comienzo de la era post-antibióticos. La
reciente pandemia del COVID-19 ha agravado y acelerado aún más la problemática.
Los antibióticos β-lactámicos son los más frecuentemente prescriptos y vendidos
debido a su alta tolerancia y efectividad. Contra ellos el principal mecanismo de
resistencia es la expresión de enzimas que los hidrolizan, las llamadas β-lactamasas. Se
dividen en dos grupos; las serín-β-lactamasas (SBLs) catalizan la ruptura del anillo β-
lactámico mediante un residuo de serina activado y se dividen en 3 clases A, C y D. La
clase A son las enzimas más estudiadas y frecuentemente encontradas en ambientes
hospitalarios y fuera de él. Las metalo-β-lactamasas (MBLs) para efectuar la catálisis son
dependientes de Zn(II). Se dividen en tres subclases, las B1 y B3 poseen un centro di-
Zn(II) y las B2 uno mono-Zn(II). Si bien también difieren en su rango de actividad y
topología del sitio activo, todas comparten su mecanismo catalítico para la hidrólisis de
los carbapenemes.
Esta creciente resistencia a antibióticos se ve agravada por dos factores
principalmente. Uno de ellos es la ausencia de inhibidores de MBLs, que puedan ser
administrados con junto a los antibióticos ya existentes. Estas enzimas clínicas tienen un
amplio rango de sustrato y son una de las principales amenazas en ambientes
hospitalarios. Por otro lado, otra de las importantes complicaciones de la resistencia a
antibióticos es la rápida adaptabilidad y evolución de las β-lactamasas. Esta característica
pone en peligro que la introducción en la clínica de nuevos antibióticos o inhibidores se
vuelva obsoleta rápidamente. En el presente trabajo de tesis, ambas problemáticas fueron
estudiadas.
Dado que las tres subclases de MBLs difieren significativamente el diseño de
inhibidores de amplio espectro plantea serias dificultades. Sin embargo, al compartir el
mecanismo catalítico, la estructura química de cada una de las especies estabilizadas e
involucradas en el mismo puede ser empleada para diseñar inhibidores que las imiten.
Previamente se habían reportado a las bistiazolidinas (BTZs) como inhibidores en el
rango μM de las tres subclases de MBLs. Estos compuestos imitan a las penicilinas; poseen dos anillos de 5 miembros, un tiol como grupo de anclaje al sitio metálico y un
carboxilato, similar al presente en las penicilinas y carbapenemes. Durante una parte de
este trabajo de tesis se diseñaron variantes de BTZs con el objetivo de evaluar la
esencialidad y función del tiol y carboxilato. Adicionalmente se evaluaron diversas
sustituciones que permitan aumentar la potencia inhibitoria. De todos los compuestos
analizados, la inclusión de un anillo aromático a las BTZs fue la que conllevo el aumento
más marcado en la potencia inhibitoria. Dicho inhibidor restauro la acción de los
carbapenemes en E. coli recombinantes expresando NDM-1 y en Enterobacterales
clínicas portando enzimas B1; no mostró toxicidad en células eucariotas.
Posteriormente, se diseñó una estructura que simule al intermediario y producto de
la hidrólisis de las penicilinas, las llamadas 2-mercaptometil-tiazolidinas (MMTZs). Son
compuestos monocíclicos que portan un tiol para unión a los centros metálicos, un
carboxilato, similar al que contienen las penicilinas y los carbapenemes y un átomo de
nitrógeno y de azufre en el anillo de 5 miembros. Las seis MMTZs que se sintetizaron
difieren en la presencia o no de un gem-dimetilo, que simula al presente en las penicilinas,
y en su estereoquímica. Todos los inhibidores fueron activos, en el rango sub-μM contra
preparaciones de las enzimas: NDM-1, VIM-2, IMP-1 (B1), Sfh-I (B2) y L1 (B3).
Muestran modos de unión muy conservados, en las enzimas B1 están estabilizado por
medio de una interacción S-π aromático con el residuo en la posición 87. En las subclases
también B2 y B3 las interacciones S-π aromático contribuyen al modo de unión de las
MMTZ. Aunque diferentes factores serían los responsables de establecer los similares
modos de unión en los tres sitios activos estructuralmente diferentes. Los compuestos
restauraron la actividad de los carbapenemes contra un panel de Enterobacterales clínicas
portando MBLs B1 y E. coli recombinantes expresando enzimas B2 y B3; no mostraron
toxicidad contra varias líneas celulares eucariotas.
Finalmente, uno de los mecanismos evolutivos de las β-lactamasas fue estudiado.
Luego de la introducción de cada una de las clases de antibióticos β-lactámicos en la
clínica, las SBLs clase A se adaptaron a los nuevos blancos, otorgando a la bacteria
resistencia a los mismos. Lo lograron mediante la incorporación de substituciones,
generando nuevas variantes, o con la inclusión de nuevas familias de enzimas. Esto
generó un variable rango de sustratos en la misma clase. Sin embargo, una característica
que todas comparten es la dificultad de hidrolizar a la ceftazidima, una cefalosporina de
tercera generación, dada su complejidad estructural y gran tamaño. Las variantes que han
surgido usualmente adoptan sustituciones que amplían el tamaño del sitio activo y permiten unir e hidrolizar a la ceftazidima más eficientemente. Sin embargo, dentro de la
familia de CTX-M, surge en la clínica una variante de CTX-M-14, CTX-M-16 que porta
dos sustituciones en la misma hoja β. Ninguna de las dos está en el Ω-loop, uno de los
sitios típicos que es tuneado para la expansión del sitio activo. Es más, se reportó
previamente que las estructuras cristalografías de las enzimas libres son altamente
superponibles siendo los sitios activos todos de igual tamaño. En esta tesis, mediante
RMN, fue analizada la dinámica de la enzima salvaje, de CTX-M-16 y las dos simples
mutantes, que también fueron identificadas en la clínica. Se observó que, en escalas de
tiempo rápidas, todas las enzimas tienen una estructura rígida. Sin embargo, la doble
mutante aumenta notablemente su flexibilidad, en escalas de tiempo lentas, en todos los
bucles que rodean al sitio activo. Con lo que se propone que dicha enzima accede a un
estado conformacional que adopte un sitio activo agrandado, lo cual le permita una tener
mayor eficiencia catalítica frente a la ceftazidima. Posiblemente esta sea otra de las
estrategias evolutivas de esta clase de enzimas que le permitiría adaptarse a nuevos
blancos; toleran un aumento en la dinámica lenta, pero conservan la rigidez en
movimientos rápidos.
Descripción
Palabras clave
β-Lactamasas, Evolución, Inhibidores, Serin-beta-lactamasas, Metalo-beta-lactamasas, CTX-M, NDM