Identificación y desarrollo de nuevas moléculas inhibitorias de mecanismos de patogénesis bacteriana

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2022

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El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ regula numerosos fenotipos de virulencia en Salmonella enterica. La proteína sensora PhoQ alterna su estado de autofosforilación en respuesta a la disponibilidad de Mg2+, CAMPs, LCUFAs y variaciones de pH y osmolaridad en el medio, lo cual define el nivel de fosforilación del regulador de respuesta PhoP que activa la expresión de genes necesarios para la virulencia de Salmonella. Este sistema constituye un blanco estratégico para la búsqueda y desarrollo de compuestos que modulen específicamente su acción, destinados a la identificación y diseño racional de nuevos compuestos con potencial farmacológico que prevengan la capacidad infectiva de esta bacteria patógena. Como parte del trabajo de tesis del Dr. Gastón Viarengo, se estableció que el blanco de acción de los LCUFAs en el mecanismo de transducción de señales del sistema PhoP/PhoQ es la actividad autoquinasa de la proteína sensora PhoQ. En este sentido, durante el presente trabajo de tesis evaluamos el accionar de los LCUFAs a nivel molecular sobre la HQ PhoQ. Esta proteína presenta dos regiones transmembranas resultando en un dominio citoplásmico (PhoQc) y un dominio sensor periplásmico (PhoQp), siendo este último el posible encargado del reconocimiento de la señal. Trabajando con PhoQp soluble y purificado, se realizaron ensayos biofísicos para estudiar la interacción de los LCUFAs con la HQ PhoQ. Mediante ensayos de TS en presencia de concentraciones crecientes de ácido linoleico en configuración cis (c,c-18:2) y de ácido esteárico (18:0), identificamos una disminución de la Tm de PhoQp dosis-dependiente al aumento de la concentración de c,c-18:2 adicionado respecto a la proteína sin agregado o con 18:0. Este efecto en la Tm también lo presenciamos al examinar la estereoespecificidad en el accionar de los LCUFAs sobre PhoQp, trabajando con el ácido linoleico en configuración trans (t,t-18:2), y el ácido linoleico conjugado (CLA). Así, establecimos un efecto desestabilizante de PhoQp ante la presencia de los diferentes ácidos grasos insaturados, que no es esteroespecífico y que no se observó en presencia del ácido graso saturado de igual longitud. La asignación del espectro 1H-15N-HSQC-RMN de PhoQp en las condiciones previamente trabajadas, permitió identificar los aminoácidos afectados por la presencia de c,c-18:2 y CLA. De esta manera, identificamos que la región de la lámina β2 y β3 y su loop conector de PhoQp se vieron alterados ante la presencia de c,c-18:2 y CLA. En los ensayos de TS y 1H-15N-HSQC-RMN se trabajó paralelamente con MgCl2 en el medio como control, ya que el catión Mg2+ extracelular actúa como ligando de la proteína PhoQ interaccionando específicamente con PhoQp. En primer lugar, los ensayos de TS evidenciaron un efecto del MgCl2 sobre PhoQp contrario al observado con los LCUFAs, identificado como un aumento de la Tm de la proteína ante concentraciones crecientes del ligando. En segundo lugar, la técnica de 1H-15N-HSQC-RMN de PhoQp con c,c-18:2 y en presencia y ausencia de MgCl2 20 mM determinó que el efecto estabilizante que ejerce el catión divalente sería dominante y diferente frente al accionar de los LCUFAs sobre PhoQp. Esto se reflejó en la superposición del espectro de PhoQp con MgCl2 y c,c-18:2 que mostró un patrón similar al espectro de PhoQp en presencia de solamente MgCl2. Así, establecimos que los LCUFAs modifican conformacionalmente a la HQ de manera reversible y tendrían un sitio de acción sobre PhoQp diferente a lo previamente establecido para el catión Mg2+. Con el fin de identificar el sito de acción específico de PhoQ que interaccionan con los LCUFAs se buscó obtener la estructura cristalográfica de PhoQp y c,c-18:2. Mediante técnica de cristalogénesis por medio de un cribado robótico, identificamos las condiciones iniciales para obtener cristales de PhoQp en presencia de c,c-18:2. La optimización de estas condiciones en mayor volumen permitió obtener cristales de tamaño suficientes para ser empleados en experimentos de difracción de rayos X. Sin embargo, esta alcanzó baja resolución y resultó anisotrópica por lo cual no fue posible avanzar en intentos de resolver la estructura cristalográfica de PhoQp unido c,c-18:2. En conclusión, los resultados obtenidos en esta primera etapa de trabajo de tesis establecieron el accionar de los LCUFAs como nuevos moduladores del sistema PhoP/PhoQ. Los LCUFAs actúan como ligandos de la proteína sensora PhoQ, los cuales pueden ser detectados en el curso del ciclo infectivo de Salmonella en el contenido gastrointestinal, y así modular la virulencia de la bacteria. Como segunda parte de este trabajo de tesis, se llevó a cabo una nueva estrategia para identificar nuevos compuestos con potencial farmacológico que prevengan, controlen y/o bloqueen la capacidad infectiva de S. Typhimurium. Para ellos, trabajamos con una biblioteca de 687 compuestos provistos por la compañía GSK, PKIS1 y PKIS2, diseñada con el fin de incluir nuevos perfiles de inhibición del quinoma eucariota. Como primera etapa en la estrategia de identificación, se llevaron a cabo medidas de actividad β-galactosidasa utilizando dos cepas reporteras con genes representativos perteneciente al regulón PhoP de S. Typhimurium (virK y pagC) y una cepa reportera con un gen regulado por otro TCS (tppB). Con los resultados obtenidos, y descartando aquellos compuestos que alteraron el crecimiento de las cepas reporteras utilizadas, seleccionamos los compuestos que solo afectaron la actividad de los genes regulados por el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ en un porcentaje mayor al 50%. De esta manera, identificamos dos compuestos con estas características, denominados GI261520A y GI262866A, que a su vez presentan una estructura similar. Continuando con la caracterización, realizamos una segunda etapa de selección mediante ensayos de actividad β-galactosidasa utilizando nuevas cepas reporteras de S. Typhimurium de genes pertenecientes al regulón PhoP/PhoQ (pagK, pcgM, pcgF y pipD) e incluimos compuestos con estructura análoga a los dos compuestos identificados. Así, validamos los resultados previos de GI261520A y GI262866A como moduladores del sistema PhoP/PhoQ. Además, establecimos la importancia de los sustituyentes metoxilo (GI261520A) o alcohol (GI262866A) en la posición número 6 en el anillo de quinazolina y del segundo anillo de bencilo para la actividad inhibitoria. Una vez identificadas las moléculas de interés, buscamos establecer el blanco de acción de los compuestos GI261520A y GI262866A sobre el sistema PhoP/PhoQ. Mediante diferentes ensayos de actividad autoquinasa, establecimos que ambas moléculas actúan como inhibidores competitivos del sitio de unión al ATP de la proteína de membrana PhoQ. Estos resultados fueron reforzados mediante una técnica bioinformática de acoplamiento molecular en donde se predijeron interacciones claves que se producen entre GI261520A o GI262866A con el sitio de unión al ATP del dominio citoplásmico de PhoQ. Por último, establecimos la capacidad de GI262866A y GI261520A para bloquear la supervivencia y la replicación de S. Typhimurium en el interior de células de macrófagos, mediante un experimento de infección convencional basado en el ensayo de protección a la gentamicina. Estos resultados nos permitieron postular a GI262866A y GI261520A como un agente de anti-virulencia, con potencial para combatir la infección por Salmonella. Como conclusión, en este trabajo de tesis pudimos caracterizar diferentes compuestos con actividad inhibitoria sobre el sistema de dos componentes de PhoP/PhoQ que ordenamos en dos grupos. En el primero están los LCUFAs, que tienen como blanco de acción el dominio sensor de PhoQ, y en el segundo están GI262866A y GI261520A, que interaccionan específicamente con el sitio de unión al ATP de PhoQ.

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Palabras clave

Salmonella, Sistema de dos componentes, Patogénesis bacteriana

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