Modelado quimiométrico de datos cromatográficos y cinéticos. Desarrollo de métodos analíticos aplicables a muestras complejas
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2021
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Resumen
La contaminación química consiste en la introducción directa o indirecta,
ocasionada por la actividad humana, de sustancias en la atmósfera, el agua o el
suelo que puede tener efectos perjudiciales para la salud humana o la calidad
del ambiente. Desde hace un tiempo a esta parte, la concientización sobre el
impacto de las actividades industriales y agropecuarias ha ido en aumento y
por este motivo, los gobiernos alrededor del mundo han establecido
regulaciones para minimizar sus efectos negativos. En consecuencia, los
controles ambientales han adquirido una mayor rigurosidad en su
implementación, alcanzado a nuevas clases de contaminantes.
De la totalidad de contaminantes presentes en el ambiente, en las
últimas décadas ha cobrado relevancia el monitoreo de aquellos denominados
emergentes. Un contaminante emergente es aquel que podría tener efectos
adversos sobre los seres vivos y cuya regulación legal es incompleta. La
peligrosidad de estos contaminantes radica en que su persistencia en el medio
es significativa. No sólo no se analizan durante los controles de rutina del agua
y de los efluentes sino que además los procesos habituales del tratamiento de
los mismos no los destruyen. Ejemplos de este tipo de contaminantes son los
antibióticos, las hormonas y los antiinflamatorios.
Las quinolonas constituyen un grupo de antibióticos sintéticos de amplio
espectro que derivan del ácido nalidíxico. Su mecanismo de acción consiste en
la inhibición del crecimiento bacteriano como consecuencia de su interferencia
con la enzima ADN girasa. A su vez, las fluoroquinolonas son una clase
particular de quinolonas que se caracterizan por presentar un átomo de flúor
en el anillo central, normalmente en la posición 6. Este sustituyente aumenta la
acción bactericida del medicamento. Las mismas se excretan en orina y heces
como sus metabolitos o sin modificar.
Estos antibióticos se utilizan para el control de una gran variedad de
enfermedades, dentro de las que se encuentran aquellas ocasionadas por
Salmonella y E. Coli en humanos y animales. Se aplican fundamentalmente en
medicina veterinaria, donde se administran en cantidades significativas representando una fuente importante de resistencia bacteriana. Debido a las
consecuencias sanitarias asociadas al uso indiscriminado de antibióticos, la
Organización Mundial de la Salud clasifica a estos fármacos en tres categorías, a
saber: importantes, muy importantes y críticamente importantes. A las
quinolonas se las ubica en la tercera categoría y por ello, es de suma
importancia el desarrollo de métodos analíticos selectivos y sensibles que
permitan la identificación y cuantificación de estos analitos en muestras
complejas como agua, suelo y tejidos de origen animal y vegetal.
En el presente trabajo de tesis se propuso como objetivo desarrollar
nuevos métodos analíticos que involucren sistemas cromatográficos y cinéticos
siguiendo los lineamientos de la química analítica verde (QAV), para la
cuantificación de quinolonas en matrices alimentarias y ambientales. Las
metodologías propuestas involucraron el análisis quimiométrico de datos
multivariados de origen cromatográfico y cinético.
En primer lugar, se desarrolló una metodología analítica ambientalmente
compatible que permitió la cuantificación de diez quinolonas de uso veterinario
y humano (ácido pipedímico, marbofloxacina, enofloxacina, ofloxacina,
norfloxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina, danofloxacina, enrofloxacina y
sarafloxacina). La estrategia desarrollada involucró datos de segundo orden
provenientes de experimentos cromatográficos de líquidos con detección
fluorescente. Los datos de segundo orden se emplearon en una calibración de
segundo orden y se utilizaron algoritmos quimiométricos para su resolución. El
algoritmo MCR-ALS demostró ser una metodología adecuada para cuantificar
dichas quinolonas en matrices complejas como tejidos de animales. El
tratamiento quimiométrico permitió predecir las concentraciones de las
quinolonas que coeluyeron y también la cuantificación en presencia de
interferentes (ventaja de segundo orden). De los algoritmos ensayados, se
obtuvieron los mejores resultados con MCR-ALS. El método desarrollado se
aplicó en distintas muestras de origen animal que potencialmente contienen los
analitos de interés, incluyendo riñón de vaca, hígados de pollo y vaca. El ensayo
de recuperación efectuado demuestra que el método propuesto permite cuantificar los analitos bajo estudio en un tiempo breve y de acuerdo a los
principios de la QAV.
En una segunda instancia, se propuso una metodología analítica
ambientalmente compatible, utilizando cromatografía de líquidos acoplada a
una celda en flujo en un espectrofluorómetro de barrido rápido. La resolución
de los analitos bajo estudio no se logró cromatográficamente sino mediante el
uso de algoritmos quimiométricos. De los algoritmos disponibles para procesar
datos de tercer orden, se utilizaron los algoritmos U-PLS/RTL y MCR-ALS. El
algoritmo MCR-ALS fue incapaz de resolver una de las diez quinolonas, caso
contrario a lo ocurrido en el procesamiento del mismo conjunto de analitos en
una calibración de segundo orden. Esto se debe a la menor sensibilidad del
detector utilizado para generar los datos de tercer orden respecto del utilizado
en el trabajo anterior y al menor número de matrices que pudieron adquirirse
por perfil cromatográfico. Por otro lado, las quinolonas también fueron
procesadas con U-PLS/RTL. Dicho algoritmo fue capaz de resolver
quimiométricamente todas las quinolonas bajo estudio, no obstante, debido a la
naturaleza del mismo, los indicadores estadísticos no fueron satisfactorios para
todos los analitos. Este hecho se adjudica a la incapacidad de U-PLS/RTL de
modelar cambios en los tiempos de retención y formas de las bandas
cromatográficas apropiadamente. De la comparación de las cifras de mérito
obtenidas en las calibraciones de segundo y tercer orden, se concluye que la
metodología más apropiada para resolver el conjunto de quinolonas en tejidos
de origen animal es mediante el procesamiento de datos de tres vías y no de
cuatro vías como hubiésemos esperado. La elevada colinealidad del sistema
quinolónico es resuelta satisfactoriamente utilizando un detector lo más
sensible posible.
Asimismo, se realizó una discusión sobre el uso de distintos algoritmos
multivariados para el procesamiento de datos de segundo orden de origen
cromatográfico. Se concluyó que MCR-ALS debería ser el modelo de preferencia
para modelar las propiedades de los componentes y para cuantificar los
analitos en muestras complejas con interferencias no calibradas. Todos los
modelos de PARAFAC2 se encuentran destinados a fallar bajo circunstancias generales. Esto se debe a que la restricción del producto cruzado constante, que
requiere que el solapamiento entre cualquier par de perfiles de tiempo de
elución sea constante en todas las muestras, únicamente se cumple en un
número limitado de situaciones.
En una etapa posterior del trabajo de tesis, continuando con la
cuantificación de quinolonas empleando una metodología analítica verde, se
determinaron simultáneamente cuatro fluoroquinolonas de uso veterinario
(marbofloxacina, danofloxacina, enrofloxacina y sarafloxacina) mediante una
calibración de tercer orden, utilizando datos de origen cinético. Para ello, se
empleó un espectrofluorómetro de barrido rápido y la reacción de Fenton para
seguir la evolución cinética de la degradación de las fluoroquinolonas. Se
midieron matrices de excitación-emisión de fluorescencia a distintos tiempos
de la reacción, obteniendo así los datos de tercer orden. Con el fin de aumentar
la sensibilidad de aquellas fluoroquinolonas menos fluorescentes, se agregó
dodecilsulfato de sodio. En el procesamiento de los datos se utilizó el algoritmo
quimiométrico U-PLS/RTL. El método desarrollado se aplicó a muestras de
tejidos de origen animal (hígado de vaca y músculo de cerdo) mediante un
estudio de recuperación. Los resultados obtenidos demostraron la capacidad
del método propuesto para cuantificar estos medicamentos de uso veterinario.
En conclusión, se desarrollaron estrategias analíticas novedosas y
sencillas, que empleadas en conjunto con modelados quimiométricos,
permitieron obtener metodologías de análisis de acuerdo a los Principios de la
QAV, utilizando tratamientos de muestra sencillos y experimentos cortos,
minimizando de esta manera el impacto ambiental del presente trabajo.
Descripción
Palabras clave
Cromatografía de líquidos, Fluorescencia, calibración multivariada