Biogénesis de centros Fe-S en plantas. Caracterización funcional de proteínas involucradas
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2019
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Resumen
Las mitocondrias cumplen funciones importantes en diferentes procesos celulares tales como el metabolismo energético, metabolismo del carbono y nitrógeno, homeostasis del calcio y hierro, regulación de la apoptosis, termorregulación, y en la síntesis de grupos Fe-S y hemo, indispensables para la formación de ferrosulfo- y hemoproteínas. La maduración de ferrosulfoproteínas es una de las funciones esenciales de mitocondrias y cloroplastos. Las proteínas con centros Fe-S constituyen un grupo de moléculas involucradas en variadas funciones celulares de gran importancia que incluyen la transferencia de electrones, la catálisis, la activación de sustrato y el sensado del medio. Los grupos Fe-S se cuentan entre los cofactores más antiguos y versátiles de la naturaleza. Aunque éstos se pueden formar espontáneamente in vitro, la toxicidad que presentan para la célula los iones Fe+2 y S-2 hace necesaria la presencia de un mecanismo especial para su ensamblado en el que intervienen diversas proteínas y complejos multienzimáticos. En bacterias se ha demostrado la existencia de tres operones encargados de la biosíntesis de estos cofactores denominados ISC, SUF y NIF y en eucariotas se ha descrito la presencia de un sistema homólogo al ISC en las mitocondrias.
La primera proteína de esta ruta biosintética es una cisteína desulfurasa dependiente de piridoxal fosfato. Esta enzima, que se denomina NFS1 en el sistema ISC mitocondrial, cataliza la desulfuración de la cisteína produciendo alanina y azufre elemental (S°). Posteriormente, el S° es transferido a proteínas molde, denominadas IscU en bacterias e ISU en eucariotas. Se describió además que son necesarias otras proteínas adicionales para la activación y modulación de la actividad de NFS1. Estas incluyen a la frataxina (AtFH en Arabidopsis), e ISD11, una proteína de 10 kDa solo presente en eucariotas. Se observó que AtNFS1 puede interactuar in vitro con AtFH, y esta interacción incrementa la eficiencia catalítica de AtNFS1. De esta forma, postulamos que AtNFS1, AtFH y posiblemente AtISD11 e AtISU, podrían formar un complejo funcional que sería esencial para la biogénesis de los grupos Fe-S.
Con el fin de avanzar en la caracterización cinética de la cisteína desulfurasa tipo I de A. thaliana, se expresaron los genes AtNFS1, AtISD11 y AtFH en un sistema heterólogo bacteriano. Se pudo observar que AtNFS1 no posee actividad en las condiciones estudiadas cuando se encuentra sola, sin embargo posee actividad en presencia de AtISD11 luego de una fase lag de aproximadamente 60 min. En presencia de AtFH la actividad cisteína desulfurasa aumenta y no presenta fase lag, sugiriendo que se formaría un complejo entre las tres proteínas que modula la actividad de AtNFS1. La interacción entre las tres proteínas se confirmó mediante ensayo de pull down. Además se observó que la capacidad de atenuar la reacción de Fenton por parte de AtFH se veía aumentada en presencia de AtNFS1 y AtISD11. Por otro lado, se observó que AtFH presenta actividad ferroquelatasa in vitro, y que ésta también está modulada por la formación del complejo enzimático.
Se caracterizaron las líneas mutantes y sobreexpresantes de AtNFS1 y se observó que presentan una marcada alteración de la biomasa en las plantas de 15 días, pero este fenotipo se pierde en plantas adultas. Estas plantas presentan niveles alterados en los genes de la vía de síntesis de grupos Fe-S y en la actividad de ferrosulfoproteínas. Para evaluar si la alteración en el nivel de expresión de una enzima de la vía ISC, y posiblemente el flujo de metabolitos a través de la vía, afecta el metabolismo del hierro y del azufre, analizamos los niveles de expresión de genes relacionados con el metabolismo de éstos. Se observó que varios transcriptos se encontraban alterados y a su vez el contenido y la distribución del hierro y del azufre estaban afectados en las plantas mutantes y sobreexpresantes.
Para comprender mejor la relación entre las enzimas de la vía de síntesis de grupos Fe-S y grupos hemo se midió el contenido de hemo, los transcriptos de la vía y la actividad de hemoproteínas como las catalasas. Se observó que estos niveles estaban alterados en las líneas mutantes y sobreexpresantes de AtNFS1. Además, la adición de hemina exógena recuperó la actividad catalasa de los extractos mitocondriales de las plantas mutantes. Se ha informado que AtFH está involucrada en la biosíntesis de hemo en distintos organismos. Para analizar si AtFH es la responsable de los efectos observados en el metabolismo del hemo en estas plantas, se realizó una transformación transiente mediada por A. tumefaciens de las hojas de líneas mutantes y sobreexpresantes para disminuir los niveles de AtFH, y se analizó el contenido de hemo y la actividad catalasa. La disminución en los transcriptos de frataxina se correlacionó con una disminución en el contenido de hemo y la actividad catalasa, y a su vez la disminución de AtFH y de AtNFS1 produjo una respuesta aditiva.
En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen a comprender mejor la función y regulación de algunas enzimas de la vía de síntesis de grupos Fe-S en mitocondrias de plantas. Se encontró que la formación de un complejo entre AtFH, AtNFS1 y AtISD11 es importante para modular la actividad ferroquelatasa de AtFH, como así también en la protección contra el estrés oxidativo. Además, nuestros resultados sugieren la existencia de una estrecha relación entre la vía de síntesis de grupos Fe-S, el metabolismo de hierro y de azufre y la vía de síntesis de hemo.
Descripción
Palabras clave
Centros Fe-S, Hierro, Cisteina desulfurasa, Azufre, Frataxina, Grupo hemo