Datos multivariados basados en señales fluorescentes moduladas por pH para el análisis de multicomponentes en muestras complejas
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2019
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Resumen
Las técnicas de modelado de datos multidimensionales están siendo aplicadas a un número creciente de sistemas analíticos. La combinación de datos de orden superior y algoritmos multivías permite el desarrollo de métodos para el monitoreo de muestras biológicas, ambientales e industriales complejas. Actualmente, la investigación dedicada al desarrollo y prueba de algoritmos multivariados para la evaluación de sistemas químicos progresivamente más complejos es muy amplia. Uno de los aspectos más importantes de los datos de segundo y tercer orden es mostrar la propiedad intrínseca de la ventaja de segundo orden. Esta propiedad permite, en principio, cuantificar al analito en muestras que contienen componentes inesperados, o sea compuestos no incluidos en el conjunto de calibración, que pueden ser potenciales interferentes.
Los sistemas analizados en el presente trabajo de tesis involucraron el empleo de señales espectrofluorométricas moduladas por pH, obteniéndose arreglos de datos de segundo y de tercer orden con un número representativo y balanceado de sensores en todos los modos. El análisis de estos arreglos de datos con métodos de calibración multivariada, posibilitó el desarrollo de nuevas metodologías para la determinación de compuestos pH dependientes en matrices complejas. Como señales fluorescentes se registraron espectros sincrónicos de fluorescencia (FS) y matrices de espectros de excitación y emisión de fluorescencia (MEEs), empleando un espectrofluorómetro de barrido rápido que permitió la adquisición de datos en un corto período de tiempo. El gradiente de pH se generó utilizando dos metodologías: un sistema de inyección de flujo que produce un doble gradiente de pH, y una novedosa estrategia basada en la hidrólisis in situ de la glucono–Delta–lactona para la obtención de un gradiente simple. La glucono–Delta–lactona, conocida como gluconolactona, es un ingrediente utilizado normalmente en la industria de alimentos por su capacidad para regular la acidez.
Es interesante destacar que en la literatura se han empleado datos de espectros UV–pH en flujo para la determinación de diferentes compuestos en diversas muestras; sin embargo existen pocas referencias que empleen señales luminiscentes en función de un gradiente de pH. Uno de los aspectos más atractivos de la luminiscencia es su sensibilidad, representando una interesante alternativa para la cuantificación de analitos en concentraciones a nivel de vestigios.
Cuando uno de los modos de los datos es un gradiente de pH, pueden presentarse distintos desafíos para los algoritmos de calibración multivariante: (1) cambios en los perfiles de pH de muestra a muestra, dada la posible irreproducibilidad en la generación del gradiente de pH, (2) existencia de relaciones de clausura entre las especies en equilibrio ácido–base para cada componente de la muestra, pudiendo generar una dependencia lineal en el modo pH, (3) cambios en las concentraciones de los componentes debido a modificaciones en el tiempo finito que se recolectan los datos espectroscópicos.
En una primera etapa, se emplearon datos de segundo orden: FS–gradiente de pH generado en sistema de flujo, para la determinación de ácido salicílico y su principal metabolito, ácido salicilúrico, en muestras de orina. Debido a cambios importantes en la señal de los analitos en presencia de la orina, principalmente de ácido salicilúrico, fue necesario emplear el método de adición de patrón a fin de obtener cuantificaciones apropiadas. Los arreglos de datos de segundo orden en modo adición de patrón fueron analizados empleando diferentes algoritmos: análisis paralelo de factores (PARAFAC), adecuadamente inicializado y restringido, resolución multivariada de curvas acoplada a cuadrados mínimos alternantes (MCR–ALS) y la regresión por cuadrados mínimos parciales multidimensionales (N–PLS) y su variante desdoblada (U–PLS) combinados con bilinealización residual (RBL). Si bien se lograron resultados aceptables con los distintos algoritmos empleados, las predicciones satisfactorias logradas con PARAFAC indican que el arreglo de datos cumple con la condición de trilinealidad. Esto permite afirmar que se consiguió una adecuada sincronización del sistema de flujo con el diseño experimental propuesto, sin variaciones en los perfiles de muestra a muestra en el modo pH.
Si bien el uso de datos de segundo orden está muy extendido, se registran menos casos de empleo de datos de tercer orden para construir modelos de calibración de cuatro vías y desarrollar metodologías analíticas. La introducción de una dimensión analítica adicional para obtener datos de tercer orden, posibilita un aumento en la capacidad predictiva de los modelos y una mayor tolerancia a datos altamente colineales. Los datos de orden superior permiten también lograr una gran selectividad ya que cada nuevo modo aporta un grado adicional de selectividad parcial, y una mejora en la sensibilidad debido a que se promedia el ruido instrumental en la gran cantidad de datos medidos. Por consiguiente, en una segunda etapa del trabajo doctoral, se planteó la obtención de datos de tercer orden: MEEs de fluorescencia moduladas por un gradiente de pH generado en flujo, obteniendo arreglos de datos de cuatro vías con un número representativo de sensores en todos los modos. La metodología propuesta permitió la cuantificación de fluoroquinolonas (ofloxacina, ciprofloxacina y norfloxacina) en muestras de orina, algunas conteniendo además salicilato o naproxeno. Las MEEs–pH fueron analizadas utilizando diferentes algoritmos para datos de tercer orden: PARAFAC, MCR–ALS y PLS combinado con RTL. De la misma manera que en el sistema estudiado anteriormente, los resultados satisfactorios de PARAFAC permiten afirmar que no hay pérdida de cuadrilinealidad causada por la irreproducibilidad en el gradiente de pH, ni por el tiempo finito empleado por el espectrofluorómetro en el registro de la matriz, en comparación con el tiempo transcurrido entre los puntos de pH sucesivos. Se podría concluir que las condiciones establecidas para la adquisición de datos: una alta velocidad de barrido espectral y un caudal muy lento en el sistema de inyección, posibilitan minimizar cambios en la concentración de los componentes.
Continuando con esta línea de trabajo y en base a los resultados obtenidos en el sistema anterior, se llevó a cabo la determinación simultánea de compuestos de interés en muestras de alimentos aplicando calibraciones de cuatro vías, basadas en MEEs–pH. En una primera instancia, se determinaron simultáneamente cuatro pesticidas (tiabendazol, fuberidazol, carbaril y ácido naftilacético) en tejidos de origen vegetal: hongos, lechuga, naranja y pera, empleando un doble gradiente de pH obtenido en flujo, como en los sistemas anteriores. En la etapa final de la tesis, se cuantificaron en forma simultánea cuatro quinolonas de uso veterinario (enrofloxacina, enoxacina, marbofloxacina y ácido pipemídico) en diferentes alimentos de origen animal de consumo humano: músculo de pollo, músculo de cerdo y riñón de vaca. En este caso, se utilizó un gradiente simple de pH basado en la hidrólisis de la gluconolactona.
En los dos últimos sistemas planteados, dada la complejidad de los datos y el alto grado de solapamiento espectral entre los analitos y las matrices de alimentos, fue necesario emplear un algoritmo flexible como es U–PLS combinado con el procedimiento post–calibración RTL, que separa las señales interferentes correspondientes a los tejidos y alcanzar la ventaja de segundo orden. En ambos casos, se obtuvieron límites de detección del orden de los encontrados en bibliografía, correspondientes a métodos cromatográficos comúnmente empleados para este tipo de muestras, que emplean procesos más complejos para preparar la muestra e incluso preconcentación. Las metodologías desarrolladas presentan ventajas con respecto a los métodos cromatográficos, entre ellas procesos extractivos relativamente rápidos y simples, con una reducción sustancial de la cantidad de solventes orgánicos involucrados, y el uso de instrumental sencillo.
En conclusión, en el presente trabajo de tesis se desarrollaron estrategias experimentales simples que posibilitaron la cuantificación de especies químicas pH dependientes que formaban parte de muestras complejas, como orina y alimentos.
Este desafío pudo realizarse satisfactoriamente gracias a la implementación de algoritmos quimiométricos adecuados que permitieron extraer información relevante de cada muestra y cuantificar los analitos en presencia de potenciales interferentes con alto grado de solapamiento espectral, llevando a cabo tratamientos previos sencillos, en un tiempo de análisis apropiado y sin instrumental sofisticado.
Descripción
Palabras clave
Quimiometría, Fluorescencia, Gradiente PH