Estudio de la metalo-beta-lactamasa anclada a membrana NDM-1 y análisis de su evolución clínica
Fecha
2018
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Editor
Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
Resumen
Los carbapenemes son potentes antibióticos β-lactámicos, reservados como
drogas de último recurso para el tratamiento de infecciones severas o por parte de
organismos resistentes. Desafortunadamente, la creciente prevalencia en las últimas
dos décadas de organismos con resistencia a estas drogas, en particular de las
Enterobacterias Resistentes a Carbapenemes (CRE), constituye una seria amenaza a la
efectividad del uso terapéutico de los mismos. El principal mecanismo de resistencia a
carbapenemes es la producción de carbapenemasas, β-lactamasas capaces de degradar
el antibiótico e inactivarlo. De acuerdo a su mecanismo catalítico se distinguen dos tipo
de estas enzimas: las serín-β-lactamasas que utilizan un residuo de serina en su sitio
activo para formar un intermediario covalente con el antibiótico y luego hidrolizarlo, y
las metalo-β-lactamasas (MBLs), que utilizan iones Zn(II) para posicionar el sustrato y
generar el hidroxilo que actúa como nucleófilo, sin formación de un intermediario
covalente.
NDM-1 es una de las MBLs de relevancia clínica de más reciente aparición. Desde
su identificación en el año 2008, se ha expandido con gran rapidez a nivel mundial, y ya
ha sido detectada en más de 70 países. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase
debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la
membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs
caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a
la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de
NDM-1, reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado
en bacterias. Hasta el momento se han descripto 19 variantes naturales de NDM, las
cuales difieren entre sí por un número reducido de mutaciones puntuales.
La presencia de Zn(II) en el sitio activo de las MBLs es indispensable para su
funcionamiento. El espacio periplasmático, donde actúan estas enzimas en Gramnegativos,
carece de mecanismos capaces de mantener la homeostasis de este metal,
por lo que el Zn(II) disponible para las MBLs se encuentra directamente ligado a su
concentración extracelular. Esto adquiere importancia durante una infección, dado que
el sistema inmune utiliza la respuesta de Inmunidad Nutricional para restringir la
disponibilidad de Zn(II) y otros cationes metálicos para el patógeno invasor. Como
parte de este mecanismo, los neutrófilos liberan en los sitios de infección grandes
concentraciones de calprotectina (CP), una proteína capaz de quelar con alta afinidad
Zn(II) y Mn(II). En el presente trabajo de tesis se estudió el efecto de la disponibilidad de Zn(II)
sobre la capacidad de conferir resistencia de las MBLs. En particular, se evaluó el efecto
del anclaje a membrana de NDM-1 sobre las propiedades de la enzima, haciendo foco
en su tolerancia a baja disponibilidad de Zn(II). Además, se buscó evaluar qué
características de la enzima se encuentran bajo presión de selección mediante un
análisis comparativo de sus alelos clínicos.
Para determinar el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la funcionalidad de
las MBLs, se compararon las resistencias de células de E. coli productoras de las MBLs
de mayor relevancia clínica (NDM-1, VIM-2, IMP-1 y SPM-1) en medio de crecimiento
suplementado con distintas concentraciones del quelante ácido dipicolínico (DPA). Si
bien la resistencia de todas las MBLs se vio reducida gradualmente por adición de
cantidades crecientes de DPA, se observó que distintas MBLs presentaban distintos
grados de susceptibilidad a la limitación de Zn(II). Se encontró además que la adición
de quelantes al medio de crecimiento lleva a la degradación de las MBLs, debido a que
las formas desprovistas de metal de las mismas son más sensibles a la proteólisis.
Se construyeron mutantes solubles de NDM-1 para analizar cómo afecta el anclaje
a membrana las propiedades de la enzima. Si bien estas variantes eran activas y
brindaban niveles de resistencia similares a los de NDM-1 salvaje en medio rico,
resultaban más sensibles a la reducción en los niveles de Zn(II) extracelulares, y eran
degradadas más rápidamente que la enzima salvaje cuando perdían metal. Por lo tanto
el anclaje a membrana en NDM-1 contribuye a la adaptación de la enzima a baja
disponibilidad de Zn(II), incrementando su estabilidad frente a la proteólisis.
La caracterización de los primeros 16 alelos clínicos de NDM-1 demostró que no
existen diferencias importantes entre los mismos en cuanto a la resistencia que otorgan
en medio de cultivo rico con elevada disponibilidad de Zn(II), en concordancia con
reportes previos. Sin embargo, las propiedades de los alelos difieren marcadamente
bajo limitación de Zn(II), y gran parte de ellos tienen mayor capacidad de conferir
resistencia bajo estas condiciones respecto a NDM-1. Asimismo, muchos de los alelos
presentan mayor estabilidad in vivo que NDM-1, observándose los mayores
incrementos en esta propiedad a causa de las mutaciones A233V y E152K. Por otro
lado, la mutación más frecuente entre los alelos, M154L, contribuye a la adaptación de
la enzima a condiciones de baja disponibilidad de Zn(II) mediante el incremento en la
afinidad de unión de este metal.
Se comprobó también que la localización de NDM-1 en la membrana externa
incrementa su secreción a OMVs respecto a las formas solubles de la enzima. Las OMVs (vesículas de membrana externa) son partículas esféricas formadas a partir de
protrusiones de la membrana externa de Gram-negativos, que se escinden y liberan de
la célula generando una vesícula cerrada rodeada de membrana externa y que contiene
en su lumen componentes periplasmáticos. Las OMVs son producidas por todas las
bacterias Gram-negativas, bajo todas las condiciones de crecimiento, y se encuentran
asociadas a una amplia variedad de procesos tales como adquisición de nutrientes,
formación de biofilms, comunicación celular, resistencia a antibióticos y patogénesis.
Se encontró que las OMVs que transportan NDM-1 poseen actividad β-lactamasa, y que
son capaces de proteger a células sensibles a antibióticos β-lactámicos de la acción de
los mismos. Además, la caracterización de OMVs generadas por distintos aislamientos
clínicos productores de NDM-1 demostró que estas vesículas pueden contener la
enzima así como el gen codificante para la misma. Las OMVs por lo tanto podrían
haber contribuido a la rápida diseminación de NDM-1 a nivel mundial.
Descripción
Palabras clave
Carbapenemasa, NDM-1, Resistencia a Antibióticos, Metalo-beta-lactamasa