Desarrollo de un ensayo para el tamizaje molecular en bancos de sangre de las cepas circulantes del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en Argentina
Fecha
2014-07-01
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Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
Resumen
El Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 (HIV-1) es el agente causal del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). El genoma de ARN del HIV-1 presenta variaciones genéticas significativas como resultado de mutaciones constantes, recombinaciones entre cadenas de ARN y presión evolutiva. La variación de las secuencias del virus distribuidas en la naturaleza permitió su clasificación en grupos (M, N y O), subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J y K) y variantes recombinantes. Al demostrarse que algunas cepas recombinantes con patrones idénticos de mosaicismo se han establecido y diseminado en ciertas poblaciones, se determinó clasificarlas separadamente como Formas Recombinantes Circulantes (CRF). En Sudamérica, los subtipos B y F y las recombinantes BF son los predominantes. En Argentina circulan principalmente un 30% de subtipo B y un 65% de recombinantes BF con un predominio de la CRF12_BF.
La transmisión de infecciones por el HIV-1 en período de ventana serológico (PVS) es una complicación transfusional de gran importancia. La Tecnología de Amplificación de Ácidos Nucleicos (NAT) permite la detección del agente viral en ausencia de anticuerpos y su implementación en países desarrollados redujo el riesgo de transmisión de la infección por vía transfusional. En países en desarrollo, los costos de los ensayos comerciales de origen importado y la ausencia de desarrollos biotecnológicos regionales impidieron su aplicación.
En nuestro país la mayoría de los donantes son de reposición, o sea que están presionados a efectuar la donación, y generalmente son de primera vez, por lo que la prevalencia de marcadores para enfermedades transmitidas por vía transfusional es mayor que en los países desarrollados, en los cuales la mayoría de los donantes son voluntarios y de repetición. Está demostrado que la prevalencia de infecciones transmisibles es mayor en donantes de primera vez que en los de repetición.
La mayoría de los laboratorios que realizan el diagnóstico molecular de la infección del HIV-1 en Argentina utilizan ensayos o reactivos que han sido optimizados utilizando el subtipo B como cepa de referencia. Teniendo en cuenta el aumento de la diversidad del HIV-1 observada en los últimos años, en este trabajo de tesis se desarrolló una herramienta diagnóstica que permita la detección de los subtipos y formas recombinantes del HIV-1 circulantes en Argentina. Debido a que las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (PCR y RT-PCR) son un proceso enzimático con sensibilidad extrema, la calidad del ensayo molecular, en particular con fines diagnósticos, debe ser evaluada continuamente. Para asegurar la calidad del resultado, es necesario incluir en cada reacción de amplificación controles adecuados, siendo de gran importancia la utilización de un Control Interno (CI) a fin de poder verificar la eficiencia en el procesamiento de la muestra y su idoneidad para la amplificación y detección. La producción de un CI para ensayos que amplifiquen virus con genoma de ARN, como el HIV-1, ha sido particularmente difícil debido a la labilidad intrínseca de esta molécula. Un CI apropiado para ensayos moleculares con finesdiagnósticos debe ser homogéneo, estable, seguro para el personal de laboratorio que lo manipula y capaz de verificar tanto la eficiencia en el procesamiento de la muestra como en los procesos de amplificación y detección.
En base a estas consideraciones, en este trabajo de tesis se optimizó una RT-PCR para la amplificación de un fragmento de la región gag de los distintos subtipos e inter-subtipos del HIV-1, hibridación líquida de los amplicones resultantes con sondas para cada región génica y detección en microplaca (RTPCR/ SUD). Este ensayo incorpora un CI competitivo (CICSUD) que consiste en un fago Q recombinante en el cual se han reemplazado secuencias fágicas por las del par de cebadores usados para la detección del ARN del HIV-1.
El CICSUD es añadido a la muestra de plasma, procesado conjuntamente con el ARN viral y amplificado con el mismo par de cebadores que el HIV-1 por RT-PCR. Los amplicones resultantes son discriminados mediante hibridación líquida con sondas específicas para cada target y detección colorimétrica en formato de enzimoinmunoanálisis. El CICSUD demostró ser estable al menos por 24 meses a 4°C. El sistema RT-PCR/SUD/CICSUD puede detectar todos los subtipos del HIV-1 y factible de ser validado como sistema NAT para la detección sensible y específica de las cepas del HIV-1 circulantes en Argentina en los individuos que se encuentren en PVS.
La complejidad de la infección por el HIV-1 requiere de esfuerzos continuos que permitan conocer las cepas virales circulantes y su dinámica, de modo de asegurar una eficiente vigilancia genómica en cada región geográfica. Debido a esto, en este trabajo de tesis se presenta una nueva estrategia para identificar subtipos y cepas recombinantes a través de la temperatura de fusión (Tm) obtenida mediante qPCR y análisis de curvas de disociación. La nueva estrategia fue validada con una prueba de referencia basada en filogenia y podría ser de utilidad para monitorear la evolución de la infección por HIV-1 en nuestra región. Por medio de la selección de regiones genómicas con diferencias en las secuencias nucleotídicas (longitud o contenido GC) entre los subtipos B y F del HIV-1, se pudieron discriminar estos subtipos en dos regiones virales (gag y vif) a través de las Tm obtenidas. Su aplicación en muestras clínicas derivadas de individuos infectados de la región permitió identificar una cepa como intersubtipo F1 en la región gag y como subtipo B en la vif, patrón que no corresponde a ninguna de las CRFs descriptas y que podría ser una posible recombinante con origen evolutivo en cepas circulantes en San Pablo (Brasil).
La aplicación de estas herramientas permitirá evaluar la introducción del tamizaje molecular de donantes en el ámbito público de la provincia de Santa Fe y facilitar de manera fehaciente la identificación de las cepas circulantes en nuestra región para posicionarse de manera más efectiva en el control epidemiológico de las infecciones causadas por el HIV-1.
Descripción
Palabras clave
Bancos de Sangre, Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Screening Molecular, Ensayo Molecular