Desarrollo de metodologías alternativas de purificación y concentración de alfa-amilasa desde diversas fuentes naturales
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2013-02-22
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Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
Resumen
La demanda enzimática en actividades de la industria química, alimenticia, textil, farmacéutica, etc. genera la necesidad de desarrollar técnicas de obtención y purificación de biocatalizadores que sean económicas, rápidas, que no dañen el medio ambiente y otorguen beneficios sostenidos a largo plazo. Estos diseños deberían permitir el uso de productos de desecho, materias primas renovables o materiales que puedan ser reciclados.
En biotecnología se emplean microorganismos presentes en la naturaleza en fermentaciones, panificación, fabricación de bebidas alcohólicas, quesos, etc. o a través de la ingeniería genética se producen microorganismos modificados para la producción de proteínas con importantes rendimiento y eficiencia. Esto hace que la tecnología enzimática se encuentre fuertemente ligada a los progresos en el desarrollo de biorreactores para fermentación a gran escala y cultivos celulares.
En el presente trabajo se diseñaron dos metodologías de concentración y purificación de la enzima alfa-amilasa: precipitación con polielectrolitos (PEs) y reparto en sistemas bifásicos acuosos (SBAs), con el fin de evaluar su posible aplicación a partir de diversas fuentes naturales de la alfa-amilasa, como lo son el páncreas bovino y el hongo filamentoso Aspergillus oryzae. Como fuente de polisacáridos para los cultivos del microorganismo se trabajó en el aprovechamiento de desperdicios generados por la industria agrícola, contribuyendo a la reducción y tratamiento de grandes cantidades de desechos que se acumulan y muchas veces son una fuente valiosa de productos de importancia industrial.
La enzima alfa-amilasa es una glicoproteína que hidroliza los enlaces internos 1,4) del almidón. Tradicionalmente fue utilizada en la industria alimenticia, en el procesamiento de alimentos, en la fabricación de cerveza, etc. y actualmente su espectro de aplicación se ha ampliado a la industria de productos químicos como detergentes, jabones, textiles, papel y productos farmacéuticos. Este es el motivo del interés en el desarrollo de tecnologías limpias, sencillas, rápidas y de bajos costos para la producción, recuperación, concentración y purificación de alfa-amilasa.
La primera metodología ensayada en este trabajo emplea polímeros de cadena flexible con carga eléctrica neta, llamados polielectrolitos. Estos tienen la capacidad de formar complejos con las proteínas los cuales pueden ser insolubilizados de manera reversible en función de diversas variables experimentales y condiciones del medio (peso molecular, densidad de carga y concentración del PE, pH, fuerza iónica, etc.). Así, los complejos pueden volverse insolubles y separarse del resto del medio por simple decantación. Para que el proceso sea efectivo debe lograrse que la proteína pueda ser recuperada del complejo insoluble, lo cual demanda hallar las condiciones para que el complejo se disocie, recuperando la proteína con su actividad catalítica conservada, y reciclar el PE para un nuevo proceso bioseparativo. Se emplearon como polielectrolitos, poliacrilatos de sodio de diferentes pesos moleculares promedio.
La segunda metodología se basa en el principio de reparto de macromoléculas en SBAs formados por un polímero de cadena flexible (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares promedio) y una sal (fosfato de potasio). Estos sistemas forman espontáneamente dos fases inmiscibles por encima de una concentración crítica de sus componentes: una fase enriquecida en el polímero y la otra en la sal. Macromoléculas tales como proteínas se repartirán entre las fases de estos sistemas de acuerdo a un coeficiente de reparto (Kr) que es el cociente entre las concentraciones de dicha macromolécula entre las fases superior e inferior del SBA y depende de variables inherentes al sistema, de factores del medio y de las características de la molécula que se reparte. De esta forma, para aislar una molécula desde una muestra compleja se deberán hallar las condiciones para que la misma se reparta de manera mayoritaria hacia una de las fases y los contaminantes hacia la fase contraria.
Ambas metodologías son sencillas, rápidas, económicas, no requieren de instrumental complicado, son aplicables a gran escala y utilizan polímeros de bajo costo que pueden ser reciclados para un subsiguiente paso separativo.
En este trabajo se abordó el estudio de los factores que afectan a dichas metodologías, así como también la naturaleza de las interacciones en las que participa la enzima y los efectos en su integridad funcional y estructural.
Para la metodología de precipitación con poliacrilato, en primer lugar se obtuvieron los diagramas de fase para los complejos formados con alfa-amilasa, los cuales permitieron evaluar el rango de pH y concentraciones dentro de los cuales los complejos son solubles o insolubles y seleccionar los pHs óptimos para la precipitación y redisolución de los complejos. Tratándose de polielectrolitos aniónicos, el pH de mayor interacción entre los componentes resultó ser ácido (cercano a 3,00) y por encima de 6,00 se redisolvieron por completo, con una cinética rápida que también fue determinada. Los ensayos de calorimetría de titulación isotérmica evidenciaron una interacción con efectos exotérmicos y de naturaleza mixta, que no es afectada en forma importante por un aumento en la fuerza iónica del medio, mostraron gran afinidad entre los componentes y una estequiometría que sugiere que un gran número de moléculas de enzima se unen por molécula de polímero. Su estabilidad catalítica tampoco se vio disminuida ante la presencia de los polielectrolitos dentro de su rango óptimo de pH, pero sí aumentó a pH ácido revelando cierto efecto protector de los poliacrilatos en el proceso de inactivación ácida de la enzima. Este mismo efecto protector a pHs ácidos se observó a nivel de la estructura secundaria de la proteína por espectroscopía de dicroísmo circular. Esto nos permitió verificar que el mecanismo molecular de inactivación ácida está asociado con la pérdida de estructuración de la enzima y el efecto protector de los poliacrilatos estaría vinculado con los niveles de estructuración secundaria de la misma. La estructura secundaria o terciaria de la enzima no se vio significativamente afectada ante la interacción con cantidades crecientes de los polímeros, tal como lo demuestran los estudios de espectroscopía de fluorescencia, dicroísmo circular y UV-visible. La estabilidad térmica de la enzima, analizada por calorimetría diferencial de barrido, tampoco se vio modificada de manera sustancial en presencia de los polielectrolitos, evidenciándose un modelo de desnaturalización térmica con dos transiciones (correspondientes a dominios independientes de la enzima) y de carácter parcialmente reversible. Finalmente, la precipitación de la enzima comercial (de origen Aspergillus oryzae) con los poliacrilatos arrojó rendimientos elevados, con resultados promisorios para la implementación de esta técnica sobre extractos naturales.
El reparto de la alfa-amilasa fue estudiado en SBAs con polietilenglicoles (PEGs) de distintos pesos moleculares (2.000, 3.350. 6.000 y 8.000), a pH 7,00, cuatro composiciones de fases diferentes y relaciones de volúmenes de fase unitarias. Luego de alcanzado el equilibrio de reparto, la enzima se concentró mayoritariamente en la fase inferior enriquecida en sal, excepto para los sistemas formados con PEG 2.000 donde se repartió principalmente hacia la fase polimérica. Al aumentar la masa molar del PEG el equilibrio se desplazó mayoritariamente hacia la fase inferior, indicando que el volumen excluido por el polímero podría ser un factor influyente y determinante en el comportamiento de reparto en estos sistemas. El agregado de una sal inerte a los SBAs no mejoró los resultados de reparto, mientras que el aumento en la relación de volúmenes entre las fases resultó favorable para el sistema con el PEG de menor peso molecular y desfavorable para el PEG de mayor peso molecular. Las funciones termodinámicas del proceso de reparto indicaron que, en general, el pasaje de la enzima desde la fase rica en sal a la fase rica en PEG es un proceso exotérmico que produce ordenamiento del estado final, lo cual indicaría que el proceso está conducido entálpicamente. Además, el efecto de compensación entrópico-entálpico observado también es indicio de que el agua juega un rol importante en el mecanismo de partición. Resulta de interés destacar que, a pesar de que el pasaje de la enzima de la fase inferior a la superior es un proceso principalmente exotérmico, la interacción alfa-amilasa/PEG 2.000 (analizada por calorimetría de titulación isotérmica) es de naturaleza endotérmica y de afinidad débil. Los ensayos espectroscópicos de fluorescencia y dicroísmo circular, realizados para evaluar el estado conformacional de la enzima, mostraron que las fases superiores lo afectan de manera poco significativa, mientras que las inferiores producen consecuencias algo más marcadas. Lo mismo se observó para la actividad catalítica de la enzima la cual resultó, en líneas generales, más afectada en las fases inferiores respecto de las superiores. La estabilidad térmica de la enzima no se vio alterada de manera relevante ante la presencia de PEG, según demuestran los ensayos de calorimetría diferencial de barrido.
Al aplicar los resultados obtenidos con la enzima comercial, de origen fúngico, sobre el páncreas bovino se observó que para algunos SBAs ensayados el reparto difiere entre ambas fuentes en su comportamiento y los resultados de purificación no fueron satisfactorios. Otros SBAs, en cambio, permitieron obtener elevados rendimientos con escasa purificación. La precipitación con poliacrilato también arrojó rendimientos porcentuales elevados aunque un bajo factor de purificación. Esto sugiere que estas técnicas podrían ser eficaces para concentrar la enzima pancreática pero no para purificarla.
Al trabajar sobre cultivos de Aspergillus oryzae, los resultados del reparto en todos los SBAs ensayados siguieron la misma tendencia que la alfa-amilasa comercial mostrando que algunos sistemas no son eficientes en la purificación de la proteína, pero sí lo son en cuanto a la posibilidad de concentrarla. La precipitación con poliacrilatos arrojó resultados promisorios, tanto en referencia a la purificación como rendimiento total del proceso, ya que se produce poca pérdida enzimática con factores de purificación que son coherentes con los bajos niveles de contaminantes que están presentes en estos cultivos.
En conclusión, podríamos decir que estas metodologías son eficaces como primer paso extractivo de concentración durante un proceso de purificación de alfa-amilasa. La precipitación con poliacrilato también puede presentarse como técnica de purificación primaria, evaluándose la necesidad de implementar metodologías más específicas de acuerdo a los requerimientos de pureza del producto final.
El empleo de materiales de desecho como fuente natural de alfa-amilasa (páncreas bovino) o de almidón para los cultivos de Aspergillus oryzae (desechos del procesamiento del trigo) aporta un valor extra a estos resultados tanto desde el punto de vista económico (ya que se trata de productos de partida con escaso valor comercial) pero también medioambiental, ya que contribuye a disminuir las grandes cantidades de subproductos o residuos que se generan en la industria ganadera y agrícola.
Descripción
Palabras clave
Alfa-amilasa, Purificación, Polielectrolitos, Sistemas bifásicos acuosos